基于NF-κB信号通路探讨葛根芩连汤治疗鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染机制

摘要：目前对于葛根芩连汤对鼠伤寒沙门氏菌的疗效机制的研究仅停留在菌群、肠道黏膜层面，本文以信号通路为切入点，想更深入探讨葛根芩连汤对鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染的疗效机制。受葛根芩连汤通过抑制NF-κB信号通路的活化来延缓溃疡性结肠炎的病理进程的启发，结合NF-κB信号通路为鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染机制中重要的转录因子和调控中心，推测NF-κB信号通路是葛根芩连汤作用于鼠伤寒沙门氏菌感染的关键通路之一，葛根芩连汤可能可以通过抑制NF-κB信号通路的活化来抑制肠道的炎症，达到治疗的目的。

关键词：葛根芩连汤；鼠伤寒沙门氏菌；NF-κB信号通路

1背景介绍

1.1.鼠伤寒沙门氏菌感染的流行病学研究

1.1.1鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染有高流行性、地域季节性、并发症多、易感人群低龄化等特点

鼠伤寒沙门氏菌，属于沙门氏菌B群，是一群非适应性或泛嗜性的沙门氏菌，具有广泛的宿主，是目前世界各国分离率最高的菌型之一。

流行特征：本病在全世界广泛分布，以温带及热带地区为主，卫生条件差的地区发病率高。全年均可发病，以夏秋季为多。2022年初受沙门氏菌污染的巧克力在多国导致病例^[1]，根据世卫组织报告，截至4月25日，已有比利时、法国、德国、爱尔兰、卢森堡、荷兰、挪威、西班牙、瑞典、英国和美国共11个国家报告了151例疑似与食用受污染巧克力产品有关的沙门氏菌感染病例。感染者中89%为10岁以下儿童，至少9名感染者住院。2005-2019年，大疫情网共细菌性其他感染性腹泻病例86450例^[2]，报告病例数居前三位的细菌病原体依次是沙门菌（48.96%，42325例）、副溶血弧菌（23.61%，20413例）和肠球菌（10.05%，8684例）；而在沙门氏菌的血清型中，鼠伤寒沙门氏菌位列第二。

易感人群：婴幼儿为易发人群，鼠伤寒沙门氏菌感染2岁以内的患者占半数以上，6个月内患病数最多，病情危重。由于接触性传播，可在产院婴幼儿室和儿科新生儿病房发生流行。

常见感染类型：据其临床表现可分为胃肠炎型、败血症型、病灶感染性和无症状带菌型，其中以胃肠炎型最常见，约占80%，潜伏期8-24小时，发病较急，主要表现为高热、厌食、恶心、呕吐、腹痛、腹泻。腹泻每日数次至30余次。

多严重并发症：从以往的报道来看^[3]，鼠伤寒沙门氏菌感染的并发症无论是数量上还是种类上都在不断增多。而且所累及的脏器也多，如心、肺、肝、胆囊、肠、肾、脑和骨髓等脏器。

1.1.2抗生素治疗鼠伤寒沙门菌感染存在高耐药性、低治愈率、高并发症等问题

过去对于鼠伤寒沙门氏菌感染的治疗多选用抗生素，然而刘美玲等人^[4]通过对肠道病原监测平台收集的分离于2008-2018年的109株人源鼠伤寒沙门菌研究发现，北京市鼠伤寒沙门菌对传统抗生素普遍耐药，多重耐药率达50.29%，对临床一线推荐药物环丙沙星、头孢类药物和阿奇霉素的耐药率分别为 21.10%，17.43%和5.50%。刘雪杰等人^[5]分析福州市某医院2020年腹泻病例鼠伤寒沙门菌的耐药情况，发现86株鼠伤寒沙门菌对氨苄西林、四环素和氨苄西林/舒巴坦耐药率较高（91.9%、89.5%和81.4%）；对喹诺酮类及三代头孢类药物均产生不同程度耐药。可见目前鼠伤寒沙门氏菌已经对常规抗生素产生了一定抗性，继续使用抗生素治疗很可能继续加重耐药性问题^[6]。

1.2中药治疗鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染的可行性研究

1.2.1葛根芩连汤治疗外感湿热泄泻疗效显著

泄泻是指以排便次数增多，粪质溏薄或完谷不化，甚至泻出如水样为主症的病证。西医学中因消化器官功能和器质性病变而发生的腹泻如胃肠功能紊乱、慢性肠炎、腹泻型肠易激综合征、功能性腹泻、急性肠炎、炎症性肠病、吸收不良综合征，内分泌及代谢障碍疾病如甲状腺功能亢进、糖尿病、系统性红斑狼疮、尿毒症、肿瘤及药物相关性肠炎等均可参照本病辨证施治。汉唐时期，《伤寒论》将痢疾和泄泻统称为“下利”。葛根芩连汤在《伤寒论》“太阳病，桂枝证，医反下之，利遂不止，脉促者，表未解也；喘而汗出者，葛根黄芩黄连汤主之”条文中出现，在原文中被描述为治疗“下利”的药物，结合现代医学观点，可见葛根芩连汤可以治疗泄泻，包括属于急性肠炎的鼠伤寒沙门氏菌感染。

小儿湿热泻之郁热，得葛根则表郁可解，得黄芩、黄连则暴注下迫之郁热可平;诸药共奏升清降浊之势，使表郁之热得解，下利之热迫得平，配以甘草顾护小儿脾胃之土，防升散、苦寒之过，终使腹泻得愈，脏腑阴阳寒热自和与平衡，使小儿泄泻可止，发热之外感诸症亦解。

现代药理研究证实葛根芩连汤对感染性腹泻具有抗菌、抗炎作用。张友菊^[7]等的对照实验研究结果表明葛根芩连汤及其多数组成药物对大部分试验菌株都有中至强的体外抗菌活性，具有抗菌作用；何云山^[8]等在模拟胃液研究葛根芩连汤抑菌作用的研究中，发现在消化试验结束后，沙门菌和金黄色葡萄球菌的数量与初始数量相比几乎可以忽略不计，说明葛根芩连汤在模拟胃液中对沙门菌有着较强的抑制作用；俞仪萱^[9]等认为调整肠道菌群是葛根芩连汤发挥治疗作用的重要机制，该调节机制包括：增加短链脂肪酸含量，正向调节生物学功能；上调肠道Occludin和ZO-1紧密连接蛋白表达，并促进益生菌（如普雷沃氏菌属等）形成肠道生物屏障，以占位性保护、营养竞争和产生抗菌物质等方式维护肠道屏障的完整性；减少肠道促炎因子，平衡肠道内环境。

目前葛根芩连汤广泛用于治疗菌痢、肠伤寒等肠道疾患，取得了明显疗效^[10]。滕健樣^[11]通过对葛根芩连汤进行方证研究发现葛根芩连汤最常见主治为湿热型腹泻。鼠伤寒感染符合中医湿热证特征，而葛根芩连汤由葛根、黄芩、黄连、甘草组成，具有解表、清热、燥湿的功效，正属清热化湿法。据此，我们可以认为，葛根芩连汤能够对鼠伤寒沙门氏菌感染进行治疗。

贾春华及刘渡舟等人^[12]认为鼠伤寒应属于中医的“泄泻”和“痢疾”范畴，并且以葛根芩连汤为主方加减治疗鼠伤寒。戴秀霞^[13]通过观察50例鼠伤寒沙门氏菌肠炎的患者服用葛根芩连汤加减后的症状，并与西药抗生素组对照，取得满意疗效。王喜聪^[14]采用葛根芩连汤加味治疗鼠伤寒沙门氏菌肠炎27例，并与西药治疗27例对照，两组总有效率比较有显著性差异，取得满意疗效。宋桂华等^[15]通过中医辨证分型，采用葛根芩连汤加味治疗鼠伤寒沙门氏菌肠炎51例，有效率为92.16%。

1.2.2鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染与葛根芩连汤呈“方证对应”

1.2.2.1鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染符合中医学湿热型腹泻的特征

临床上，鼠伤寒沙门氏菌感染以胃肠炎型常见，以高热、厌食、恶心、呕吐、腹痛、腹泻为主要临床表现，其中大便性状多变是小儿鼠伤寒沙门氏菌肠炎的特点，大便可为不消化稀便、黄黄绿色粘液便、水样便、脓血便，符合中医学湿热证的临床表现。

1.2.2.2鼠伤寒沙门氏菌感染常用于造模中医学湿热证动物模型

中医学研究视野下，鼠伤寒沙门氏菌多作为湿热证动物模型实验因素^[16]。王瑾^[17]等通过实验研究证明，在湿热证动物模型制作中病原微生物的感染是造成红细胞脂质过氧化损伤的主要因素，缺少病原微生物处理因素无法造出理想模型。苏奎国^[18]等以高脂气候环境+鼠伤寒沙门氏菌，制造大鼠湿热型温病气分证模型，认为该模型在症状与体征方面符合湿热证表现，血K+、血清SOD、血清MDA、内毒素变化与正常组有显著性差异。此外，吕文亮^[19]认为以鼠伤寒沙门氏菌作为生物因子制作的大肠湿热证模型，相较于大肠杆菌或其内毒素，在模型动物消化系统症状表现及症状持续时间方面表现较好，且更符合大肠湿热证“脾胃内伤、外感湿热、内外相引”的发病机制。

1.2.3目前缺乏在基因和蛋白调控层面对葛根芩连汤治疗感染性腹泻的研究

现代对于研究中医药治疗湿热型腹泻大多都是从调整菌群入手，如江月斐^[20]等人使用苓桂术甘汤治疗肠易激综合征，通过高通量测序检测出治疗组相较于对照组革兰阳性杆菌、双歧杆菌、乳杆菌、消化球菌明显上升，革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌、肠杆菌、肠球菌明显下降，肠道菌群密集度明显上升，肠道菌群多样性无明显改变；何云山^[8]等通过研究发现葛根芩连汤能抑制多种细菌的生长，葛根芩连汤在模拟肠液和胃液中均能对金葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、黑曲霉、米曲霉和青霉达到有效的抑制作用。但目前缺乏中药对于病菌感染怎样通过调控表达通路达到治疗目的的研究，因此深入到基因和蛋白调控层面探究中药对于肠道病菌感染的治疗机理，有助于新型治疗药物的研发。

1.3鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染机制和抗感染机制研究

1.3.1鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染通过T3SS激活NF-κB信号通路侵染宿主

从基因和蛋白调控的水平上讲，鼠伤寒沙门氏菌入侵肠道上皮细胞主要是通过沙门氏菌毒力岛1（Salmonella pathogenicity island 1，SPI-1）和它所表达组成的三型分泌系统（type Ill secretion system，SP1-1 T3SS）来实现的。而该菌在巨噬细胞中的存活，则离不开沙门氏菌毒力岛2（Salmonella pathogenicity island 2，SPI-2）和它所表达组成的另一个三型分泌系统（SPI-2 T3SS）。其蛋白质产物组装成像分子注射器一样的装置以及注射到宿主细胞内的毒力效应蛋白，这些毒力效应蛋白通过操控宿主细胞内的信号通路从而有利于自身的侵染和繁殖，其中一条关键的信号通路便是NF-κB信号通路。

NF-κB是非常重要的转录因子，是宿主对病原菌的炎症反应及免疫应答信号通路的调控中心，也是很多治病菌毒力效应蛋白调控的靶点。在整个感染过程中，鼠伤寒沙门氏菌通过毒力效应蛋白双向调节NF-κB信号通路来帮助自身侵染和繁殖。在侵染的初期，鼠伤寒沙门氏菌通过毒力效应蛋白来激活NF-κB信号通路从而有利于自身的侵染和繁殖：致病岛SPI-1上毒力效应蛋白Sip A、Sop E、Sop E2和Sop B都能激活宿主细胞的NF-κB信号通路。这种多因子、多途径的激活机制保证了NF-κB信号通路的超水平激活。 感染后期，另一些分泌到宿主细胞的毒力效应蛋白具有抑制免疫信号通路的作用：沙门菌通过Ⅲ型分泌系统向宿主细胞注入毒力效应蛋白。Sop E、Sop E2和Sop B通过激活Rho家族小G蛋白，从而激活NF-κB信号通路，而Spt P具有GTP酶激活蛋白（GAP）的活性，能使G蛋白失去活性。Sip A对NF-κB信号通路的激活需要NOD1/NOD2的介导。Ssp H1、Avr A以及Sse L通过抑制IκBα的泛素-蛋白酶体降解途径，最终抑制NF-κB信号通路^[21]。

1.3.2抑制NF-κB通路可以抵抗鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染

鼠伤寒沙门氏菌能通过调控操控宿主的免疫信号通路来帮助感染和入侵甚至逃逸免疫系统的清除，NF-κB通路又在免疫反应中起重要作用，是很多毒力效应蛋白作用的靶点，所以可以考虑药物通过干涉NF-κB通路将降低相关信号蛋白的表达，抑制通路活化，从而抑制肠道炎症，达到治疗目的。

肠道免疫系统是抵御微生物入侵的首道防线，由肠淋巴结-派氏结和肠系膜淋巴（MLN）组成的诱导部位和肠黏膜上皮内和固有层淋巴细胞（lamina propria lymphocyte，LPL）组成的效应部位构成^[22-24]。肠道固有层含有巨噬细胞、CD4+T细胞、DC、NK细胞等多种免疫细胞，其中巨噬细胞和NK细胞是肠道固有免疫细胞的代表，在早期抵抗肠道病原菌过程中起着关键作用。当机体受到沙门菌感染时，宿主的天然免疫系统发挥着重要的作用。

每种病原菌都具有其特定的免疫原—病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern， PAMP），可以结合宿主细胞表面的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR），如细胞膜上的Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）及胞质中的NOD样受体（nucleotide oligomerizaton domain-like receptor， NLR），从而激活宿主天然免疫系统，被宿主识别和清除掉。TLR在肠道炎症中过表达，其活化能够激活细胞内不同的NF-κB信号复合物，活化的NF-κB进入细胞核调节IL-1β，TNF-α等炎性因子的表达，启动针对病原微生物的先天免疫和适应性免疫。

1.4葛根芩连汤通过NF-κB信号通路发挥抗炎作用

目前因缺乏葛根芩连汤对鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染关于调节NF-κB信号通路机制的研究，通过查阅葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎（UC）方面的文献研究，了解到葛根芩连汤可通过抑制NF-κB信号通路发挥抗炎作用。UC和鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染都有湿热型腹泻的症状和特征，因此推断葛根芩连汤也可通过NF-κB信号通路来抑制鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染所引发的炎症以达到治疗目的。

促炎因子、抑炎因子及炎症蛋白之间的不平衡在调节炎症的发展中起着重要作用。异常的炎症反应及氧化应激为UC中重要的发病机制之一。相关研究表明，葛根芩连汤通过调节细胞因子，抑制炎症反应，抗氧化应激等对UC起治疗作用。LI等研究发现，葛根芩连汤可显著改善DSS诱导的UC小鼠体质量减轻、结肠缩短，降低疾病活动指数（DAI）评分；减轻肠道黏膜组织损伤；通过抑制MPO活性，降低丙二醛（MDA），升高谷胱甘肽（GSH）水平从而减弱了结肠中的氧化应激反应；同时减少促炎因子TNF-α，IL-1β，IL-4，IL-6的产生，降低NF-κB相关信号蛋白如TLR4p-p65，p-IκB等的表达，抑制NF-κB信号通路的活化，延缓了UC的病理进程。在体外实验中，葛根芩连汤与RAW264.7细胞共孵育处理2 h后，用LPS刺激诱导炎症模型，发现其治疗作用与动物实验相一致。此外，研究还发现，葛根芩连汤的效果明显优于中药单体成分如小檗碱、葛根素、大豆苷元、黄芩苷及甘草酸。在三硝基苯磺酸诱导的UC大鼠模型中，葛根芩连汤通过抑制MDA及诱导性一氧化氮合酶（iNOS）活性，提高超氧化物歧化酶（SOD）活性；减少TNF-α，IL-1β分泌及肠道中iNOS，细胞间黏附分子-1（ICAM-1），环氧化酶-2（COX-2），巨噬细胞炎症蛋白-2（MIP-2），TLR2，TLR4等表达，抑制NF-κB p65活性，对UC起治疗作用。以上研究均表明，葛根芩连汤可通过调节TLR4/NF-κB信号通路发挥对UC的治疗作用^[24]。

因此，推测葛根芩连汤可以通过抑制NF-κB信号通路的活化来抑制肠道的炎症，达到治疗的目的。

2探讨意义

2.1以信号通路为切入点探讨葛根芩连汤治疗鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染机制，为临床研究治疗小儿鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染以开发新药物提供新思路

目前对于小儿鼠伤寒沙门氏菌感染的治疗大多采用抗生素治疗，但该病原菌对传统抗生素普遍耐药，疗效不佳，使用不恰当甚至出现抗生素型腹泻等一系列副作用，使病情迁延，病程延长。而中医药作为中国的传统医学，有安全、毒副作用低、较少出现耐药性等特点，且鼠伤寒沙门氏菌感染导致的腹泻与中医理论上的湿热型腹泻相似，与葛根芩连汤呈"方证对应"，故采用葛根芩连汤治疗鼠伤寒沙门氏菌感染。且研究表明，临床用葛根芩连汤作为基础方治疗鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染较西药抗生素治疗有明显疗效，再次证明了葛根芩连汤治疗鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染的可行性。但对于葛根芩连汤对鼠伤寒沙门氏菌更深入的疗效机制尚不明确，我们通过文献研究的方式发现NF-κB信号通路可能是葛根芩连汤作用于鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染的关键通路之一，希望将来能有相关研究学者能通过实验探究阐释其治疗机理，为临床开发对治疗鼠伤寒沙门氏菌胃肠型感染更有效，更有针对性的新型药物提供新思路。

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