打开文本图片集

姓名：刘沛想，1989年11月，男，汉，研究员，硕士，苏州君盟生物医药科技有限公司，研究方向：蛋白制剂

王静，1989年，女，汉，苏州吴江，研究员，硕士，苏州君盟生物医药科技有限公司，研究方向：分析科学。

冯辉，1976年，男，汉，江西，总经理，博士，上海君实生物医药科技股份有限公司，研究方向：生物大分子

陈祥，1978年，男，汉，盐城，教授，博士，扬州大学，从事人兽共患病与免疫学、诊断制剂与生物制药研究

[摘要] 目的：开发便于存储和给药的高浓度特瑞普利单抗皮下注射制剂。方法：本研究通过对缓冲体系和稳定剂进行研究，筛选出低粘度且稳定性良好的高浓度制剂处方。结果：制剂处方组成为10 ～ 30 mmol·L-1 组氨酸和盐酸组氨酸，120 ～ 180 mmol·L-1盐酸精氨酸，0.02 ～ 0.08 % 聚山梨酯80，pH 5.5 ～ 6.5，特瑞普利单抗的浓度为160 ～ 200 mg·mL-1。研究结果表明皮下和静脉两种给药方式的的质量和稳定性高度可比，具有良好的可生产性和开发前景。此外，在食蟹猴和小鼠体内开展的药代动力学和药效学研究，结果表明两种给药方式的药代动力学和药效学具有高度的可比性。结论：因此，这些研究数据可支持特瑞普利单抗高浓度皮下制剂的临床开发和评价。

[关键词] 特瑞普利单抗；处方开发；高浓度制剂；皮下制剂；药代动力学；药效学

[中图分类号]  R945；R979.1      [文献标识码] A      [文章编号]

引      言

近年来，抗体药物在生物医药领域发展迅速。随着PD-（L）1靶点蛋白结构的确证，临床上，越来越多针对PD-（L）1 免疫检查点的单克隆抗体药物被不断开发并应用于治疗死亡率高、治愈率低的多种癌症中，该靶点药物已经被广泛发现与应用[1]。免疫治疗逐渐占据肿瘤治疗的主流地位的大趋势，但所有批准的免疫检查点抑制剂基本都是静脉注射，接受免疫治疗的患者获得持久的反应和长期生存，使肿瘤患者对生存质量有了更高期待。2021年11月份首款皮下注射PD-L1恩沃利单抗在中国获批上市，此次获批上市意义重大。以PD-（L）1单抗为代表的的肿瘤治疗药物，皮下给药的潜在好处日益凸显。

皮下注射和静脉注射最大的区别是改善给药方式，但皮下制剂给药对蛋白浓度要求较高，高浓度制剂面临工艺开发、稳定性和分析方法等方面的挑战[2，3]。高浓度制剂与低浓度制剂相比，更容易产生蛋白聚体和亚可见微粒，使药物产生免疫原性[4-16]。高浓度药物粘度增大，给浓缩换液和灌装工艺均带来挑战，降低粘度使生产化和使用成为可能[17，18，]，提高产品竞争力和病人依从性。

本实验中，我们成功开发高浓度皮下制剂处方。并对皮下高浓度制剂开展了稳定性研究，同时评价皮下和静脉给药在食蟹猴的药代动力学和小鼠的药效学对比研究。

材      料

蠕动泵（Watson Marlour）；高效液相（Waters）；紫外分光光度计（C technologies）；粘度计（RheoSense）；膜包（Millipore）；恒温培养箱（北京兰贝石恒温技术有限公司）；医用冷藏箱（青岛（海尔）电器）。

特瑞普利单抗（批号：2020004Q21;2221009Q11）和特瑞普利单抗安慰剂（批号：P20210401; 20201010）（苏州君盟生物医药科技有限公司）；食蟹猴（广西桂东灵长类开发实验有限公司）；B-hPD-1人源化小鼠（百奥赛图江苏基因生物科技有限公司）；枸橼酸-枸橼酸钠-蔗糖-组氨酸-盐酸组氨酸-甘露醇-盐酸精氨酸（Merck）；海藻糖（Pfanstiehl）；2R西林瓶（Schott）；13mm覆膜胶塞-铝盖（West）；生理盐水（济民健康管理股份有限公司）。

方      法

1  检测方法

1.1蛋白浓度  采用分光光度计进行蛋白浓度测定，消光系数设定。用超纯水作为空白校正后测定样品，向比色皿中加入样品，点击“检测”按键，并记录数据。

1.3  SEC-HPLC纯度  采用分子排阻色谱法进行SEC检测。流动相组成为50 mmol·L-1 磷酸盐，300 mmol·L-1 磷酸钠，pH 7.0。采用峰面积归一化对结果进行定量分析。分别计算单体、聚体和片段的峰面积百分比。

1.3  CEX-HPLC纯度  采用弱阳离子交换色谱进行CEX纯度检测。流动相组成为A相：10 mmol·L-1 二水合磷酸二氢钠溶液（pH 4.7）；B相：10 mmol·L-1 十二水合磷酸氢二钠溶液（pH 9.2）。采用峰面积归一化法进行定量分析，分别分析酸性峰、主峰和碱性峰的峰面积百分比。

2  样品制备方法

经细胞复苏、上游发酵，然后通过亲和层析、阳离子层析和阴离子层析三步纯化，制备出原液，使用超滤膜包进行浓缩换液或透析方式至对应制剂处方中。

3  药代动力学方法

根据特瑞普利单抗前期和静脉制剂临床应用剂量，本研究拟采用剂量4 mg·kg-1，本试验共分2 组，每组3只，雌雄兼有，1组为皮下给药组，1组为体静脉给药组。静脉给药组：在无菌下使用生理盐水稀释至0.8 mg·mL-1，输注时间为30 min，采用恒速输液泵，静脉取样点为0 min（药前）、0.5 h （输注结束）、2 h、6 h、24 h、72 h、168 h、240 h、336 h、504 h、672 h、840 h、1008h。皮下给药组：采用安慰剂稀释至所需浓度，给药体积0.5 mL·kg-1，后肢大腿外侧注射，皮下取样点为0 min（药前）、0.5 h （输注结束）、1 h、4 h、8 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h、240 h、336 h、504 h、672 h、840 h、1008 h。

4  抗体体内药效方法

将MC38细胞以1×106每0.1 mL-1浓度接种于B-hPD-1人源化小鼠的右后背皮下，待肿瘤生长到大约105 mm3时按肿瘤体积挑选42只随机分组，每组7只，共3组，分别为：G1 Placebo组、G2 iv组、G3 sc组。iv为静脉给药，Placebo和sc均为皮下注射，每周给药2次，连续给药6次，末次给药4天后结束实验。给药和观察期间每周测量2次小鼠肿瘤体积，并记录计算肿瘤体积抑制率（TGITV%）。

结      果

1  稳定剂处方研究

基于本产品上市的静脉给药低浓度处方选用柠檬酸和柠檬酸钠缓冲液pH 6.0，而柠檬酸缓冲液易引起注射疼痛感，皮下制剂选用pH 6.0常用的组氨酸和盐酸组氨酸缓冲液，筛选不同辅料对蛋白粘度和稳定性的影响。精氨酸盐酸盐和氯化钠等能有效降低高浓度制剂粘度 [7，17，18]，蔗糖和海藻糖等二糖能够维持蛋白构象稳定性的特性[8，11，12]。基于上市的特瑞普利单抗给药剂量，皮下制剂目标浓度为180 mg·mL-1，FS1-2处方增加190 mg·mL-1和200 mg·mL-1，最后加入0.02%的聚山梨酯80，开展稳定性考察。方案如表1。

使用粘度仪对处方T0 进行粘度检测，同时考察样品在长期稳定性（2 ～ 8 ℃）和高温（40 ℃）的稳定性，在2周、4周取样，进行浓度、外观、SEC纯度和CEX主峰纯度等检测。

1.1粘度结果  含盐酸精氨酸和氯化钠的处方有效的降低粘度，处方FS1-2粘度最低仅有5.5 cP。另外，在处方FS1-2中，我们观察到随着浓度的增加，粘度呈指数增长，浓度190 mg·mL-1和200 mg·mL-1条件下粘度分别为9.3 cP和12.3 cP，其他处方粘度均在7 ～ 10 cP之间。

1.2SEC纯度和CEX纯度  对候选处方开展了长期和高温稳定性研究，结果如表2，长期条件下放置4周，所有处方纯度均无明显变化。高温条件下FS1-4处方单体纯度含量由99.6%下降至98.8 %，其余处方SEC纯度未见明显变化；所有处方CEX主峰纯度均降低，其中FS1-3处方CEX主峰纯度由75.5 %下降至53.7 %，下降幅度最明显。稳定性实验结果显示处方FS1-2和FS1-5表现较优，因此选择稳定剂蔗糖和盐酸精氨酸开展进一步研究。

2  pH缓冲体系和稳定剂研究

通过初步研究出的稳定剂盐酸精氨酸和蔗糖，设计组氨酸和盐酸组氨酸pH 6.0缓冲液，同时和上市的特瑞普利单抗静脉给药的制剂处方（FS2-3）对比进行稳定性对比。将样品换液至对应处方，浓度为180mg·ml-1，进行稳定性研究。方案如表3。

2.1  SEC纯度和CEX纯度稳定性研究  我们对候选处方开展了高温和长期稳定性研究，检测结果如表4，长期条件下放置4周，纯度均无明显变化。高温条件下放置4周，FS2-3处方SEC单体纯度下降最快由99.8 %下降至98.8 %；所有处方CEX主峰纯度均减少，其中FS2-3处方主峰纯度下降最快由79.2 %下降至59.7 %。稳定性结果表明处方FS2-2整体表现较优。

3  高浓度制剂的生物利用度较好

食蟹猴注射PD-1抗体皮下制剂，同时设定PD-1抗体静脉给药组，给药剂量均为4 mg·kg-1，通过检测血清中药物浓度，评估PD-1抗体不同给药途径的药代特征[19]。高浓度制剂与静脉制剂给药的药代动力学结果见表5和图1，结果表明，食蟹猴单次注射PD-1抗体，高浓度制剂与静脉制剂给药时半衰期（t1/2）和清除率（CLs）具有高度的一致，皮下注射的生物利用度为95.9 %，药代动力学研究具有高度的可比性。

4  高浓度制剂与静脉制剂在荷瘤小鼠模型中具有相似的抗肿瘤效果

高浓度制剂与静脉制剂对hPD-1小鼠移植MC38结肠癌模型的抗肿瘤作用，hPD-1小鼠：每组7只，雌性；给药剂量0.3 mg·kg-1，每周给药1次，共给药6次。结果如表6和图2，结果显示，在实验终点（即给药后第21天），静脉注射在0.3 mg·kg-1剂量下的TGITV%为63.3 %，皮下注射在0.3 mg·kg-1 剂量下的TGITV%为56.3 %，皮下和静脉给药与安慰剂对比均表现出明显的抑瘤作用。

讨    论

基于高浓度制剂研究策略，开发了特瑞普利单抗皮下注射液的制剂处方。通过对pH缓冲体系、稳定剂和表面活性等稳定性研究，解决了粘度和稳定性的问题。确定蛋白浓度180mg·L-1，处方成分为20 mmol·L-1组氨酸盐缓冲液 pH6.0、150 mmol·L-1精氨酸盐酸盐和0.02 %聚山梨酯80。

对特瑞普利单抗注射液开展药代动力学和药效学研究。药代动力学结果表明，食蟹猴单次注射PD-1抗体，给药剂量4 mg·kg-1，t1/2在50-55 h之间，CLs在0.331-0.336 mL·h-1·kg-1。皮下与静脉给药的半衰期及清除率具有高度的药代动力学可比特性。药效结果表明，在hPD-1小鼠移植MC38结肠癌模型的抗肿瘤药效作用中，皮下和静脉给药在0.3 mg·kg-1 的剂量条件均显著性抑制肿瘤生长，肿瘤抑制率分别为56.3 %和63.3 %，与Placebo对照组给药后第21天统计学比较有显著差异（P<0.01）。在本研究基础上，特瑞普利单抗皮下注射液已于2022年3月7日获得CDE批准开展临床试验（受理号：CXSL2101506）。

皮下注射方式的出现，将大大提高患者给药的依从性、便捷性和安全性，甚至可形成门诊式肿瘤治疗。与现有的静脉注射免疫检查点抑制剂相比，皮下注射方式是一种有效的替代方法[20]。后续我们继续对PD-1肿瘤抑制剂的皮下制剂开展稳定性和临床研究。在疗效提升的同时，不断探究创新剂型和创新给药方法的优化，全方位改善肿瘤患者的免疫治疗现状。     [参考文献]

[1]吝建华，韩君，徐寒梅. PD-1 /PD-L1 免疫检查点抗体药物制剂稳定性开发 [J].中国生物工程杂志， 2020， 40（10）： 35-42.

[2]邱晓，罗建辉. 重组单克隆抗体药物制剂处方的作用及相关审评要点 [J]. 中国新药杂志， 2019， 28（16）： 1947-1954.

[3]吴晓丽，杨青，罗建军. 抗体A 的制剂处方研究 [J].食品与发酵科技， 2017， 53（1）.