HRSV是一种非节段性的有包膜的、单股负链RNA病毒，属肺炎病毒科，正肺病毒属。病毒形状有圆形和丝状体，外膜有突起，病毒直径约为150nm。HRSV只有1个血清型，分A、B亚型。HRSV 基因组全约为15.2 kb，从 3′端到 5′端顺序有 10 个基因，依次为 3′ -leader-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-trailer-5′，共编码11种蛋白质，其中包括 2 个非结构蛋白、9 个结构蛋白。非结构蛋白NS1、NS2 的主要功能为抑制干扰素合成，参与免疫逃逸。内结构蛋白有核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）和多聚酶亚单位蛋白（L）。核衣壳蛋白（N）与磷蛋白（P）为病毒核酸合成提供场所，基质蛋白（M）可以有效抑制宿主细胞转录。多聚酶亚单位蛋白（L）则是病毒核酸转录和复制过程必须的成分。由于M2 mRNA中两个重叠的开放阅读框编码不同的蛋白M2-1和M2-2，蛋白相关蛋白M2-1所包含的转录因子与病毒转录有关。 M2-2 调控蛋白由M2 下游开放阅读框编码，负责病毒颗粒组装中 RNA 的合成。病毒包膜包含三种表面蛋白，糖蛋白（G）、融合糖蛋白（F）和小疏水蛋白（SH）。糖蛋白（G）在宿主细胞附着中起作用，融合糖蛋白（F）负责病毒融合和进入细胞，而功能尚未清楚的小疏水蛋白（SH）可能与病毒感染相关。HRSV重要的抗原蛋白糖蛋白（G）和融合糖蛋白（F）诱导机体产生中和抗体，因此也是目前单克隆抗体和疫苗研究的主要靶蛋白。糖蛋白（G）的胞外部分组成为1个高度保守的中心区和两侧的2个高突变区，进一步根据 G蛋白第二高突变区的序列特征将A、B亚型分成不同基因型[1，2]。

HRSV全球均有流行，并且有明显的季节性。在温带气候区域，如我国， HRSV 的流行季节在南方为夏秋季，北方为冬春季，流行高峰南方为7月和8 月，北方为 12 月至次年 3 月[3]。人呼吸道合胞病毒主要导致急性下呼吸道感染，常见咳嗽、咳痰、喘憋、发热和呼吸音异常等细支气管炎和肺炎的基本症状，严重者会出现哮喘综合征、呼吸道阻塞、肺不张甚至呼吸衰竭。在早产和患有先天性心脏病的幼儿，患有慢性肺疾病和免疫缺陷的老年人死亡率较高[3，4]。

1.人呼吸道合胞病毒检测及分型方法研究进展

快速高效的病原体检测方法对于人呼吸道合胞病毒的早期诊断和早期治疗有重要的意义。目前有多种检测方法应用于人呼吸道合胞病毒的实验室检测，包括微生物学法、免疫学法以及分子生物学法。

1.1微生物学方法

病毒分离培养是检测人呼吸道合胞病毒感染的金标准。将咽拭子、痰液等新鲜临床标本接种于喉癌细胞 （Hep-2）、人Ⅱ型肺泡上皮细胞（A 549）、人宫颈癌细胞系（HeLa）等易感细胞进行培养。培养条件为于 37℃，5％ CO2，显微镜下观察接种后的易感细胞[5]。若出现细胞病变以及典型的细胞融合现象，则判定结果为阳性。但病毒分离培养对技术操作有较高的要求，且易受样本质量影响，若样本病毒载量较低，易出现假阴性结果。并且操作繁琐，耗时长费用高，因此临床应用较少。

1.2免疫学方法

免疫学方法是以特异性免疫原理为基础的检测方法，可分为间接免疫荧光法和直接免疫荧光法。与病毒分离培养相比，具有操作简单，可靠性强，灵敏度高等优点。但该方法成本高，灵敏度和特异性不稳定，且只能对单个病毒进行检测。

1.3分子生物学技术

近年来，随着分子生物学技术的不断发展，实验室检测人呼吸道合胞病毒方法也从微生物学检测和免疫学检测发展为分子生物学检测。随着分子生物学的发展，除了传统的基础PCR方法外，多种新的诊断技术被应用到临床，如环介导等温扩增（LAMP）、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、巢式PCR、恒温扩增技术和基因芯片等多种分子检测技术也广泛应用于 HRSV 的实验室诊断。

1.3.1  LAMP技术 人呼吸道合胞病毒的LAMP技术针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在60--65℃进行恒温扩增，也被称为逆转录LAMP（RT-LAMP）。该方法恒温扩增，扩增阶段对仪器要求低，反应速度快，敏感性好，特异性高。但缺点是无法进行高通量且设备昂贵、检测成本高。

1.3.2  RT-PCR技术 RT-PCR是检测诊断包括人呼吸道合胞病毒在内的多种病原体常用的方法。针对人呼吸道合胞病毒的F基因、N基因、M基因、L基因，有研究设计了基于Taqman探针的检测方法，可以检测并对人呼吸道合胞病毒进行分型[7]。与巢式RT-PCR和ELISA检测相比，RT-PCR敏感性高，更适用于临床样本。

1.3.3  qRT-PCR技术 人呼吸道合胞病毒qRT-PCR检测技术分为相对定量法和绝对定量法，相对定量只能粗略计算初始模板病毒载量的相对比值。由于相对定量法操作简单，无需考虑扩增效率，是现阶段病毒定性定量分析主要应用的方法，但缺点是结果准确性低、误差较大。绝对定量法利用荧光信号的实时变化检测PCR扩增过程中每个循环扩增产物量的变化，对起始模板病毒载量进行精确的定量分析。与于相对定量相比较，具有高特异性，强灵敏度，可操作强和可重复性好，定量准确和高扩增效率的优点[8]。

1.3.4 多重聚合酶链反应  有研究使用多重PCR技术同时对呼吸道病毒进行检测和分类，针对IV血凝素、核蛋白基因、人呼吸道合胞病毒核衣壳蛋白基因设计相关引物进行检测，优点为快速，特异、灵敏，可检出包括人呼吸道合胞病毒在内的18种呼吸道病毒，可在多种呼吸道病毒爆发时进行检测，但无法对人呼吸道合胞病毒A、B亚型进行分型[9]。

1.3.5  Sanger测序 基于Sanger测序法的G 蛋白 HVR2、G 蛋白全基因、F 蛋白全基因序列测序常常用于人呼吸道合胞病毒的分子流行病学研究领域。将RT-PCR与Sanger技术结合，针对人呼吸道合胞病毒G、F蛋白和G蛋白HVR2保守区设计引物，对G 蛋白HVR2片段、G 蛋白全基因、F 蛋白进行扩增以获得全基因序列。将测序得到的结果在NCBI中进行Blast比对分析，可对病毒进行分型。使用DNAStar和MEGA等软件进行同源性分析、序列比对以及构建进化树，可精得人呼吸道合胞病毒的基因型别并进行溯源分析。传统的全基因组测序需要进行分段式PCR扩增，而且通常需要对该病毒进行分离培养以获得含有较高拷贝数的病毒核酸样品；受限于核酸样品易降解和PCR扩增效率等因素，对于低拷贝数的样品进行分段式PCR扩增时难以获得目的病毒基因的完整序列[10]。

1.3.6 高通量测序 高通量测序是一种快速高效的全基因组测序技术，又称二代测序、下一代测序（NGS），优点为准确率高、数据量大、速度快，可以对多个样本进行同时测序。随着各种高通量测序平台的发展和应用，宏基因组测序和扩增子测序技术也不断应用于各种病原体的直接检测，目前已有包括针对用于流感病毒、寨卡病毒、登革热病毒和新型冠状病毒等病原体的高通量靶向测序技术在实际工作中得到使用[11]。基于高通量平台的宏基因组测序技术可以对临床标本中的病原体进行无偏移的定量和诊断，但其结果高度依赖于数据分析人员的经验和判断，且测序成本较高。同时临床样本复杂多样，有时相对于待测样本中宿主的核酸背景水平，目标病毒载量过低，通过宏基因组检测技术会获得大量与目标病毒无关的数据，实验结果难以获得令人满意的基因组测序深度[12]。

相比较于宏基因组测序，靶向扩增子测序有许多优点。有研究通过对目的病原基因组序列分析、设计覆盖全基因组序列的多重PCR扩增引物组，通过多重聚合酶链式反应对待测样本中特定病原微生物基因组进行扩增，使测序数据中待测病原基因组比例显著增加，提高了数据的有效利用，降低了单份样品的测序成本。传统的人呼吸道合胞病毒全基因组测序方法对病毒载量要求较高，依赖于病毒分离培养技术，并且采用多个节段的长片段扩增。PCR扩增过程中每个反应体系仅包含一对引物及一段靶基因，操作过程繁琐且耗费时间、试剂。如若样本病毒载量低，则可能出现PCR扩增失败导致大量基因片段缺失，数据无法有效覆盖整个病毒基因组，导致实验人员难以对测序结果进行准确判读。人呼吸道合胞病毒靶向扩增子测序可以在短时间内完成对特定目标的扩增，与其他方法相比，具有操作简便、成本低廉测序通量需求少、检测量高、反应快速等优势。

2.结语

人呼吸道合胞病毒在儿童、成年人、老年人尤其是免疫缺陷患者导致严重下呼吸道感染及较高的死亡率，是世界卫生组织公认的严重公共卫生问题，在全世界范围都有过暴发流行。因此，对于人呼吸道合胞病毒的检测及分型研究具有重要意义[1]。

随着科学技术的发展和新型技术的开发和应用，有关人呼吸道合胞病毒的检测方法和分型方法的研究也有了新的进展。本文总结了现阶段人呼吸道合胞病毒主要检测及分型方法，每种方法都有其优缺点。相信随着科学技术的不断进步，人呼吸道合胞病毒的检测及分型方法也会逐渐完善。

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