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摘要：目的：深入分析甘露醇在转移因子口服冻干粉制剂多肽含量测定过程中产生的具体影响。方法：需要利用紫外分光光度法分别对0.27%的甘露醇转移因子口服冻干粉制剂和不含甘露醇的转移因子口服冻干粉制剂进行测定，同时还要将牛血清白蛋白作为对照组进行分析，准确掌握甘露醇对转移因子口服冻干粉制剂的多肽含量测定产生的具体影响。在制备标准品时需要获取标准曲线，并对两种溶液的吸光度进行对比。结果：经过研究分析，0.27%的甘露醇溶液在650nm的吸光度并不会对实验结果产生影响；但0.27%的甘露醇福林酚溶液在650nm部位的吸收会对多肽测定结果产生影响。并且不同来源的甘露醇与福林酚溶液表现出来的显色反应存在极大差异，吸光度值在5倍以上。结论：在对转移因子口服冻干粉制剂中多肽含量进行测定时，利用同一种0.27%的甘露醇福林酚进行测定，可以保证实验结果的可靠性。

关键词：甘露醇；转移因子；冻干粉制剂；多肽含量；测定影响

前言

目前，在甘露醇应用过程中，其对多种疾病都有一定的效果，并且甘露醇是对肠道通透性进行研究的重要指标。在甘露醇含量测定过程中，主要包括高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法以及气相色谱法等。转移因子口服冻干粉制剂作为从健康猪脾或者牛脾提取的物质，是一种白色粉末，是比较突出的免疫调节药。在测定过程中可以利用福林酚法进行冻干粉制剂中的多肽含量测定工作。但是在实际测定中，甘露醇会对测定结果产生一定影响。因此，需要准确掌握甘露醇对转移因子口服冻干粉制剂中多肽含量测定的具体影响，才能够在实验过程中对相关影响因素进行有效控制，提升实验结果的可靠性。具体实验报告如下。

1研究资料与研究方法

1.1研究试剂准备

1.1.1碱性铜试液制备。取氢氧化钠10g以及碳酸钠50g，加入400mL水后进行溶解，作为A液，之后利用酒石酸钾0.5g加50mL水后进行溶解为B1液；取硫酸铜0.25g，加水30mL后进行溶解为B2液。将B1与B2液体混合，作为B液使用。在使用之前还要对A液和B液进行混合并加水到500mL。

还要准备不同来源的甘露醇试剂A、B、C、D。

1.1.2对照品溶液制备。在对照品溶液制备过程中需要取牛血清白蛋白作为对照品，加水制作成浓度为0.3mg/mL的溶液[1]。

1.1.3供试品溶液制备。取转移因子冻干粉制剂利用水进行溶解制作成多肽浓度为0.15mg/mL的溶液。

1.1.4制备标准曲线。在标准曲线制备时需要精密移取对照品分别为0mL、 0.1mL、 0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL。将移取的所有溶液放置在试管内，加水到1mL。标准管分别加入碱性铜试液1mL，混合均匀，然后各试管加入福林酚溶液4mL，混合后放置在55℃的水浴温度下反应5分钟，之后放置在冷水浴中，持续10分钟。将0管作为空白对照组。根据紫外分光光度法的要求测定在650nm部位的吸光度。根据对照品溶液浓度和对应的吸光度进行计算。吸光度作为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，完成标准曲线绘制。

1.2研究方法

在对多肽供试品中多肽含量进行测定时，需要移取供试品1mL，根据标准曲线的相关方法分别加入碱性铜试液和福林酚溶液进行测定。获取供试品溶液的具体浓度后乘以稀释倍数可以计算多肽含量。

分析甘露醇对多肽含量测定产生的具体影响时，需要进行平行实验，主要以空白管、标准管和测定管为基础分别加入0.27%的甘露醇进行检测，重复检测3次。利用最终的平均值作为检测数值进行计算。

2研究结果

2.1甘露醇A水溶液和甘露醇A福林酚溶液吸光度

2.2不加甘露醇A的线性

2.3加甘露醇A的线性

2.4加不同甘露醇的福林酚溶液吸光度

对加同种甘露醇的0.27%甘露醇水溶液以及含量为0.27%的甘露醇福林酚溶液（空白管）吸光度进行分析，发现0.27%甘露醇水溶液在650nm的吸光度在0.005以下，代表甘露醇分子在650nm部位的吸光度不会对实验结果产生影响。但是甘露醇与福林酚溶液在650nm部位存在较大吸光度，会对多肽含量测定结果产生影响，且不同来源的甘露醇影响也相差较大。

3讨论

福林酚法作为一种对多肽含量进行测定的主要方法，在应用过程中蛋白质和碱性铜溶液中的铜离子络合会导致肽键伸展，暴露出络氨酸以及色氨酸。在碱性铜条件下与福林试剂发生反应，试剂中的磷钼酸－磷钨酸会受蛋白质铜复合物产生的络氨酸以及色氨酸残基还原影响出现蓝色物质。在浓度范围一定的情况下，颜色深浅和蛋白质中的络氨酸和色氨酸含量为正比关系，波长650nm部位的吸光强度比较高。利用比色法可以对蛋白质浓度进行测定。但是在该方法应用过程中，受硫酸铵、钾离子、镁离子、硫醇化合物以及碳水化合物等干扰会对测定结果产生影响。福林酚法对蛋白质进行测量的灵敏度更高，是目前应用比较广泛的方法[2]。

在本次研究过程中，浓度为0.27%的甘露醇水溶液在650nm波段吸光度保持在0.005以下，代表甘露醇分子在650nm部位的吸收并不会对实验结果产生影响。但是0.27%的甘露醇福林酚溶液在650nm处有明显的吸光度，会对多肽含量的测定结果产生影响。

经过研究分析，在对是否加了甘露醇为辅料的转移因子口服冻干粉制剂进行测定时，应该利用标准品中同时加或者不加甘露醇的方法进行测定：当在标准品内不加入甘露醇时，回归曲线可以将0点计入其中，利用测定空白管可以获取准确的计算结果。但当标准品中加甘露醇时，在回归曲线计算过程中并不需要将0点计入其中，否则可能会导致回归系数无法达到0.995要求。

经过此次研究，确定了不同来源的甘露醇与福林酚溶液的显色反应差异比较大，吸光度值相差最高在5倍以上，差值为0.07以上。因此，在检测过程中，利用甘露醇作为辅料的转移因子口服冻干粉制剂进行检测时，空白管必须要利用相同型号的甘露醇，才能保证实验结果的准确度。

参考文献：

[1]郭宁子，张伊洁，许明哲，等.多肽微球注射剂中甘露醇含量测定研究[J].药物分析杂志，2020，40（6）：6.

[2]蔡慧侠.一种转移因子胶囊中多肽的定量检测方法：，CN109239219A[P].2019.