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【摘要】目的：分析改良碳青霉烯灭活试验（mCIM和eCIM）对耐碳青霉烯肠杆菌目（CRE）表型及分布研究。方法：收集我院2021年8月-2023年12月共纳入103例患者，进行临床细菌分离，剔除同一患者同一部位的重复菌株，共筛选分离出138株CRE菌株。使用全自动细菌鉴定仪进行细菌分离试验，采用PCR法检测CRE耐药基因，分析mCIM/eCIM与碳青霉烯酶抑制剂增强试验结果。结果：我院2021年8月-2023年12月共纳入103例患者，分离出138株CRE菌株，其中肺炎克雷伯菌97株，占比70.29%，黏质沙雷菌15株，占比10.87%，大肠埃希菌26株，占比18.84%；其中重症医学科78株，占比56.52%，神经内科重症病房30株，占比21.74%，呼吸内科8株，占比5.80%，老年病科4株，占比2.90%，神经外科病区4株，占比2.90%，胸心外科病区14株，占比10.14%。138株CRE中，检出101株产KPC-2，7株产KPC-3，23株产NDM-1，5株产NDM-5，2株同时产KPC-2与NDM-1；97株肺炎克雷伯菌中，93株产KPC-2，4株产NDM-1；15株黏质沙雷菌中，8株产KPC-2，7株产KPC-3；26株大肠埃希菌中，19株产NDM-1，5株产NDM-5，2株同时产KPC-2与NDM-1。以PCR结果为标准，对于108株产KPC的菌株，mCIM/eCIM可准确鉴定106株，敏感性为98.15%（106/108），特异性为100%；与PCR比较，Kappa值为0.984。对于28株产NDM和2株同时产KPC和NDM的菌株，mCIM/eCIM可全部准确鉴定，但mCIM和eCIM无法鉴定同时产KPC和NDM的菌株；与PCR比较，Kappa值分别为1.000和0.560。对于108株产KPC的菌株，碳青霉烯酶抑制剂增强试验可准确鉴定105株，其敏感性为97.22%，特异性为100%；与PCR比较，Kappa值为0.972。对于28株产NDM菌株，碳青霉烯酶抑制剂增强试验可准确鉴定27株，敏感性为96.43%，特异性为100%；与PCR比较，Kappa值为0.976。结论：mCIM和eCIM对CRE型检测敏感性较高，可快速准确的鉴定CRE表型，且操作简单，具有较少的干扰因素，临床使用价值较高。

【关键词】改良碳青霉烯灭活试验；乙二胺四乙酸碳青霉烯灭活试验；耐碳青霉烯肠杆菌目；碳青霉烯酶抑制剂增强试验

引言

碳青霉烯类药物具有较好的细胞通透性，且酶稳定性较高，可用于多重耐药肠杆菌目细菌的治疗[1]。随着临床抗菌药物的过度使用，耐碳青霉烯肠杆菌目细菌（CRE）在全球检出率逐渐增加，对临床抗感染治疗带来了较大困难[2]。研究显示[3]，CRE的主要耐药机制为携带碳青霉烯酶基因，且该基因在转移质粒中均有存在，且可在不同菌株之间进行传播，故及时有效的对CRE感染进行鉴定，在感染治疗中较为重要。mCIM和eCIM试验可对肠杆菌科细菌碳青霉烯酶表型进行筛查，两者联合使用，可对金属酶、丝氨酸酶碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌进行区分，且该检测方式操作简单，可为临床抗感染用药提供参考[4-5]。基于此，本文分析mCIM和eCIM对CRE表型及分布的检出率。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集我院2021年8月-2023年12月共纳入103例患者，进行临床细菌分离，剔除同一患者同一部位的重复菌株，共筛选分离出138株CRE菌株。

1.2 方法

1.2.1细菌分离剂鉴

临床各科室对标本进行采集、送检，标本由微生物室进行分离培养，鉴定使用全自动细菌鉴定仪（Maldi-tof质谱仪，德国Bruker公司）严格按照《全国临床检验操作规程》规定操作方法对标本分离、培养、鉴定。

1.2.2 基因检测

对138株CRE菌株进行基因检测，使用煮沸法，将NDA模板提取出，放入分离平板，进行菌落挑取，在菌落中加入无菌水500µL，加热至100℃，水浴10min，进行离心处理（12000r/min，10min），取上层清液，使用PCR法检测KPC-2、KPC-3、NDM-1、NDM-5基因，若碳青霉烯酶基因为阴性，则对超广谱β-内酰胺酶基因以及膜孔蛋白Omp K35、Omp K36基因进行检测，若碳青霉烯酶阳性，则序列测定扩增片段，并将序列提交美国国家生物技术信息中心数据库，通过基本局部匹配查询工具比对，确定碳青霉烯酶基因型别。

1.2.3 碳青霉烯酶抑制剂增强试验

取待测菌，将其调至为0.5麦氏浊度菌悬液，在M-H琼脂平板均匀涂抹，并取4张标记为A、B、C、D的10µg/片的亚胺培南纸，贴于M-H琼脂平板，纸片粘贴距离应＞5mm。B纸片添加10µL初始浓度为0.1mol/L的乙二胺四乙酸，C纸片添加10µL初始浓度为30mg/L的3-氨基苯基硼酸，D纸片添加10µL乙二胺四乙酸+10µL3-氨基苯基硼酸，进行过夜处理，后测量纸片抑菌圈直径，B纸片抑菌群≥A纸片5mm，表明该受试菌产NDM，C纸片抑菌群≥A纸片5mm，表明该受试菌产KPC，D纸片抑菌群≥A纸片5mm，表明该受试菌产KPC与NDM。

1.2.4 mCIM/eCIM试验

mCIM步骤：将1µL环取一环过夜培养的新鲜纯菌落加入2mL TSB试管，混匀，在试管中放入含有10µg美罗培南的无菌纸片，35℃下孵育4h，使用10µL接种环将美罗培南纸片取出，贴于试管内壁，并将多余水分挤出，后将纸片贴于涂有大肠埃希菌的平板，35℃下孵育24h，对抑菌圈直径进行测量。结果判定：碳青霉烯酶阳性：抑菌圈直径为16-18mm，或存在散在菌落；阴性：抑菌圈直径为≥19mm。

eCIM步骤：在TSB试管中加入20µL 0.5mol/L的EDTA溶液，并将1µL环取一环过夜培养的新鲜纯菌落加入2mL TSB试管，其余步骤同mCIM试验。结果判定：阳性：eCIM与mCIM试验抑菌圈直径相差≥5mm；阴性：eCIM与mCIM试验抑菌圈直径相差＜4mm。

1.3 统计学处理

采用SPSS 18.0软件进行统计分析。以PCR结果为标准，比较2种方法鉴定不同碳青霉烯酶的效能。采用Kappa检验评价2种方法与PCR方法的一致性，Kappa值<0.4表示一致性较差；0.4<Kappa值≤0.8表示一致性较好；Kappa值>0.8表示一致性极好。

2 结果

2.1 菌株分布情况

如表1所示，我院2021年8月-2023年12月共纳入103例患者，分离出138株CRE菌株，其中肺炎克雷伯菌97株，占比70.29%，黏质沙雷菌15株，占比10.87%，大肠埃希菌26株，占比18.84%；其中重症医学科78株，占比56.52%，神经内科重症病房30株，占比21.74%，呼吸内科8株，占比5.80%，老年病科4株，占比2.90%，神经外科病区4株，占比2.90%，胸心外科病区14株，占比10.14%。

2.2 138株CRE耐药基因分布

如表2所示，138株CRE中，检出101株产KPC-2，7株产KPC-3，23株产NDM-1，5株产NDM-5，2株同时产KPC-2与NDM-1；97株肺炎克雷伯菌中，93株产KPC-2，4株产NDM-1；15株黏质沙雷菌中，8株产KPC-2，7株产KPC-3；26株大肠埃希菌中，19株产NDM-1，5株产NDM-5，2株同时产KPC-2与NDM-1。

2.3 mCIM/eCIM与碳青霉烯酶抑制剂增强试验菌株表型筛选试验结果

如表3、表4所示

3 讨论

随着临床碳青霉烯类抗菌药物在肠杆菌科细菌感染中的不断应用，CRE感染检出率逐渐升高，使临床感染导致的死亡例数不断上升，故快速、准确的对CRE型别检测，在临床抗菌药物的选择，降低患者死亡率，控制院内感染与传播中具有重要作用。

肠杆菌科细菌为革兰阴性杆菌，在肠道内表达较高，为医院感染的主要致病菌，机体内免疫力下降，可导致泌尿道、呼吸道、血流、消化道发生感染。碳青霉烯类抗生素具有较强的抗菌能力，可对革兰阴性菌感染进行控制，但随着抗生素的不断使用，肠杆菌科细菌耐药性逐渐升高，细菌是否对碳青霉烯耐药的判断方式主要为药物敏感性试验，但CRE的试验判断结果低于美国临床实验室确定的耐药折点，主要原因为部分肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物具有较低的水解能力，可导致敏感菌株发生耐药，且不同产酶类型菌株使用抗菌药物治疗后效果不同，故对菌株产酶类型进行鉴别较为重要。本文研究显示，mCIM/eCIM对KPC、NDM的检测敏感性较高，且与PCR检测的一致性较高，可应用于菌株表型的检测。

临床对于CRE的主要控制方式为早期检测与控制感染，研究显示，CRE对耐碳青霉烯的主要耐药机制为产碳青霉烯酶、超广谱β-内酰胺酶过度表达、膜孔蛋白缺失，其中产碳青霉烯酶为导致CRE耐药的主要机制，故快速、准确的检测方式可早期对CRE表型检测。药敏研究显示，CRE对碳青霉烯类菌具有较强的耐药性，且对临床常用抗生素敏感性较低，CRE感染患者多存在较多的基础疾病，临床治疗药物选择较为困难，故可使患者的经济负担增加，并促进患者死亡。本文研究显示，我院检出的138株CRE菌株，最为常见的是肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌，多在患者痰液中检出，且在重症医学科室中菌株检出率较高，原因可能为，重症医学科中患者病情较重，机体免疫功能较差，患者进行留置中心静脉导管、侵入性器械、引流管、置尿管、机械通气等侵入性操作，可使患者感染发生风险增加，加重患者病情。

综上所述，CRE菌株最为常见的是肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌，mCIM和eCIM试验可对CRE表型进行检测，且对KPC、NDM、KPC+NDM型CRE检出能力较好，具有较高的敏感性与特异性，与PCR检测具有较高的一致性，可用于临床微生物的检测，并根据不同基因型菌株耐药特点选择合适的抗菌药物，防止CRE的进一步扩散。

参考文献

[1]尚佳文，徐文娜，许南松，等. mCIM和碳青霉烯酶抑制剂增强试验检测CRE和CRPA产酶表型的方法学评价[J]. 现代检验医学杂志，2023，38（3）：165-169.

[2]张青，陈喆，李克诚，等. 改良Hodge与Carba NP和mCIM试验快速检测产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的方法学比较[J]. 中华医院感染学杂志，2019，29（10）：1441-1446.

[3]包海林，花鸿燕，孙恒亮，等. 改良Carba Np试验和mCIM/eCIM快速鉴定产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌表型的临床应用[J]. 检验医学，2022，37（10）：963-968.

[4]何红，黄紫嫣，李军，等. 改良Hodge试验、CNPt及mCIM筛选肺炎克雷伯菌产碳青霉烯酶的价值[J]. 中国感染控制杂志，2019，18（5）：375-379.