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摘要：建立了一种本试验建立了气相色谱串联质谱法快速测定植物油中氯丙醇酯及缩水甘油酯的方法。样品经溴代、水解和衍生后，用气相色谱串联质谱仪测定，同位素内标法定量。通过对样品溴代、水解、衍生化和GC-MS/MS检测条件的优化，氯丙醇酯和缩水甘油酯在3～72ng/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数R2>0.999，方法检出限均为10μg/kg，定量限均为30μg/kg；。平均回收率为90.1%～109.5%，测定结果的相对标准偏差不大于6.0%（n=6）。该方法具有简单、高效、灵敏、准确等特点，可为植物油中2-氯丙醇酯、3-氯丙醇酯及缩水甘油酯污染水平的日常监测提供技术支持。

关键词：植物油；氯丙醇酯；缩水甘油酯；气相色谱串联质谱；

氯丙醇酯（MCPDE）和缩水甘油酯（GE）是近十几年来国内外备受关注的新型食品污染物[1-5]。氯丙醇酯主要为3-氯-1，2-丙二醇脂肪酸酯（3-MCPDE）和2-氯- 1，3-丙二醇脂肪酸酯（2-MCPDE），而缩水甘油酯则是缩水甘油与不同脂肪酸组成的缩水甘油脂肪酸酯单体。氯丙醇酯和缩水甘油酯普遍在植物油高温精炼过程中生成[6-7]。

有研究表明氯丙醇酯在动物肠道中被胰酯酶分解为相应氯丙醇[8]，由此表明3-MCPDE和3-MCPD均具有肾脏和生殖毒性，并可能具有致癌性[9-11]，国际癌症研究机构（IARC）将其列为2B类致癌物[12-13]。关于2-MCPD的毒理学的研究目前较少，但据有关报道摄入高剂量2-MCPD时，对心脏、横纹肌、肝脏等造成较大伤害[14-15]。缩水甘油酯水解后生成缩水甘油，具有致癌性和遗传毒性[16-17]，被IARC确定为2A级致癌物。

目前我国尚未制订国家标准对3-MCPDE和GE的限量做出明确规定。国内外均仅对3-MPCDE代谢产物3-MCPD进行了限制，欧洲食品安全局（EFSA）设定3-MCPD酯的TDI为2 μg/kg[18]；GB 2762 国家标准仅对添加酸水解植物蛋白的调味品进行限量：液态调味品为0.4mg/kg，固态调味品为1.0mg/kg[19]；欧盟（EU）2018/290号法规对于GE的最大限值是：植物油脂为1000 µg/kg[20]。目前国内外测定食品中MCPDE和GE方法主要是通过碱水解或酸水解等方法水解成MCPD和Gly，将其衍生化后供气相色谱质谱仪测定。标准化方法有美国分析化学家协会（AOAC）法[21]、德国DGF法[22]等，本研究拟采用酸性酯交换间接分析法，建立气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）测定植物油中氯丙醇酯和缩水甘油酯的方法，以期能有效的降低仪器色谱柱的损害，同时实现植物油中三类污染物快速定性定量测定，最终采用实际样品验证本方法的稳定性和可行性，为该类物质监测提供技术参考和数据支撑。

1材料与方法

1.1   材料与试剂

实验用水均为超纯水。

甲醇（ CH3OH ） ：色谱纯，默克化工技术（上海）有限公司。

异辛烷（ C8H18 ） ：色谱纯，上海麦克林生化科技股份有限公司。

丙酮（ CH3COCH3 ） ：色谱纯，默克化工技术（上海）有限公司。

四氢呋喃（ C4H8O ）：色谱纯，默克化工技术（上海）有限公司。

硫酸（ H2SO4）：含量 ≥95%，优级纯，永华化学股份有限公司。

苯基硼酸（ C6H7BO2 ）：纯度 ≥97%，默克化工技术（上海）有限公司。

溴化钠（ NaBr ）：纯度 ≥99. 5%，优级纯，上海麦克林生化科技股份有限公司。

氢氧化钠（ NaOH ） ： 优级纯，上海麦克林生化科技股份有限公司。

无水硫酸钠（ Na2SO4） ： 优级纯，上海麦克林生化科技股份有限公司。

碳酸氢钠（ NaHCO3） ：优级纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸二酯（ C35H67ClO4 ， CAS号51930-97-3）； 2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸二酯（ C39H75ClO4 ， CAS号26787-56-4 ）；缩水甘油棕榈酸酯（ C19H36O3 ， CAS号7501-44-2 ）；D5-3-氯-1， 2-丙二醇棕榈酸二酯；D5-3-氯-1，2-丙二醇棕榈酸二酯（C35H62D5ClO4，CAS号1185057-55-9，缩写D5-3-MCPDE）；D5-2-氯-1， 3-丙二醇硬脂酸二酯（ C39H70D5ClO4 ， CAS号1329796-49-7 ，缩写 D5-2-MCPDE ）；D5-缩水甘油棕榈酸酯（ C19H31D5O3 ， CAS号1794941-80-2 ，缩写D5 -GE） ：纯度100μg/mL，均购自上海安谱。

1.2   仪器与设备

气相色谱-质谱仪：Agilent8890-7000D， 美国安捷伦公司；

电子天平：PX224ZH/E型，感量为0.0001 g，奥豪斯仪器（上海）有限公司；

电子天平：SQP型，感量为0.00001 g，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；

实验室用超纯水机：Milli-Q Academic型，美国密理博公司；

超声波仪：KH7200B型，昆山禾创超声仪器有限公司；

涡旋振荡器：Multi Reax型，德国海道尔夫（Heidolph）公司；

离心机：TDL-80-2B型，上海安亭科学仪器厂；

氮吹仪：N-EVAPTM111型， 美国OA公司。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：HP-5MS石英毛细管柱，30m×0.25mm（id）×0.25μm；色谱柱温度（程序升温）：80℃保持1min，以20℃/min速率升温至200℃，再以50℃/min速率升温至300℃，保持2min；进样口温度：270℃；载气：氦气（99.999%），流速1.2ml/min；进样方式：恒流，不分流进样，1min后打开分流阀；进样量：1uL。

1.3.2 质谱条件

离子源温度：280℃；传输线温度：300℃；四级杆温度：180℃；离子源：EI源，70ev；溶剂延迟：6min；测定方式：选择反应监测方式（MRM）；优化后的保留时间定量定性离子对及其碰撞能量信息见表1。

1.4 实验步骤

1.4.1试样提取

1.4.1.1植物油脂、动物油脂

称取试样0.1g（精确至1mg）于15mL离心管中，准确加入内标工作液（2.00μg/mL ）50μL，混匀，供水解。

1.4.2溴代

于标准系列溶液、上述试样溶液中加入2mL四氢呋喃，涡旋溶解，作为待反应液。向待反应液中加入40μL酸性溴化钠溶液（溴化钠6g/L，含6%（V/V）硫酸），旋紧盖子，涡旋混合，在50℃水浴反应15min；加入3mL碳酸氢钠溶液（6g/L）终止反应。 随后加入2mL正己烷，涡旋振荡15s，静置，取上清液于另一15mL离心管中，再用正己烷重复提取1次，合并提取液，40℃氮吹至近干，加入1mL四氢呋喃溶解残渣，备用。

1.4.3 水解

向待水解液中加入1.8mL硫酸⁃甲醇溶液 （1.8%，V/V），涡旋混合10s，旋紧瓶盖，置于40℃恒温水浴中反应16h。加入0.5mL饱和碳酸氢钠溶液终止反应，涡旋 10s，氮吹除去有机溶剂。 再向剩余液中依次加入2mL硫酸钠溶液（200g/L），2mL正己烷，涡旋混合10s，静置分层后，弃去上层正己烷相，再用正己烷重复萃取1次，弃去上层，得到下层净化液备用。

1.4.4 衍生化

于净化后的水溶液中加入100μL 苯基硼酸溶液，涡旋后静置反应5min，加入 1mL异辛烷涡旋30s提取，静置分层，取上层溶液经无水硫酸钠脱水后过0.45μm尼龙微孔滤膜后供气相色谱-串联质谱仪检测。

1.4.5 空白对照

除不加试样外，与试样同步操作进行，测定结果应低于检出限。

1.4.6 标准曲线的制作

添加系列标准工作溶液和内标溶液，采用与试样操作完全相同的步骤进行。

2 结果与分析

2.1 溴化反应条件的优化

通过研究溴代反应中的不同溴代试剂浓度、反应温度和时间考察了酸化溴化钠对缩水甘油酯转化率（3-MBPD单酯）的影响，采用单因素试验，每种条件重复测定三次，考察了溴化钠溶液用量（20μL、40μL、60μL、80μL和100μL），溴化反应温度（30℃、40℃、50℃、60℃和70℃）和溴化反应时间（5 min、10 min、15 min、20 min和25min）对缩水甘油酯转化成3-MBPD单酯效率的影响。取1μg/mL混合标准工作溶液100μL，按上述条件进行前处理，在溴化反应条件下，GE的峰面积结果见图1-3。从图1-3中可以发现，随着溴化钠溶液用量、反应温度和时间的增加缩水甘油酯的转化率也增大，在40μL，50℃和15min时GE衍生产物峰面积响应达到峰值，因此选取添加40μL 50℃下反应15min作为溴化反应的最佳条件。

2.2衍生化反应条件的优化

水解产物3-MCPD，2-MCPD和3-MBPD是水溶性小分子，极性大、沸点较高，若直接进行气相色谱质谱分析效果并不好，因此采用衍生剂衍生化后生成沸点更低、相对分子质量更大的物质，以方便气质测定。本方法使用苯基硼酸作为衍生化试剂，与氯丙醇反应生成非极性环状化合物，选择性强。取1μg/mL混合标准工作溶液100μL，按上述条件进行前处理，考察了衍生剂PBA的用量（20μL、50μL、100μL、200μL和300μL）和衍生时间（5min、10min、15min、20min和30min），每种用量重复实验三次，结果如图4-5所示。从图中可以看出，当衍生化试剂的用量由20μL逐渐增加到100μL时，3个物质的响应值（以峰面积计）增长明显，但当衍生化试剂的用量继续增加到300μL时，目标物的响应值增量逐渐趋于平缓。综合考虑实验成本以及仪器和色谱柱的寿命，最终确定PBA 的用量为100μL。衍生化时间和目标物化合物的响应值之间关系不明显，反应5min后目标物已充分衍生化，为提高检测效率，选择衍生化时间为5min。

2.3色谱质谱条件优化

将2-MCPD、3-MCPD和GE及相应内标配置成200ng/mL的单个标准溶液，经溴代、水解、衍生后，用全扫描方式进行测定，从而得到各目标化合物的特征离子，在根据母离子挑选响应高的子离子，最后优化碰撞能量。根据目标化合物色谱保留时间优化气相色谱-质谱的升温程序，在保证目标物分离的条件下选择20℃/min升温速率，缩短检测时间提高工作效率。优化后的MRM总离子流图见图6，由图6中可以看出，3种目标化合物在上述GC-MS/MS色谱质谱条件下响应及分离度良好；选取响应高且干扰少的监测离子，可以降低背景噪声对低浓度目标物的定性定量干扰，提高检测灵敏度，在选择离子监测模式下，3种目标化合物及其内标的定量和定性离子对见表1。

2.4方法评价

2.4.1标准曲线、检出限和测定下限

取标准工作溶液依次进样，经色谱分离质谱检测得到2-MCPDE、3-MCPDE和GE的校正曲线。

通过向在阴性大豆油、菜籽油、玉米油等样品中添加目标物来考察方法的检出限（S/N=3）、定量限（S/N=10）。由表2知，3-MCPD、2-MCPD和GE在3-72ng/mL浓度范围内线性良好，R2＞0.995，通过试验得到本方法3-MCPD、2-MCPD和GE的检出限为10μg/kg，定量限为30μg/kg。说明本方法具有较高的灵敏度。

2.4.2 方法的回收率及精密度试验

按本实验方法操作，本实验室对阴性大豆油、菜籽油、玉米油（称样量=0.1g）样品进行1倍、2倍、5倍定量限的三个添加浓度的平行加标回收试验（n=6），回收率及精密度结果见表3-表5。2-MCPDE加标回收率在91.7%-108.2%之间，3-MCPDE加标回收率在90.1%-106.9%之间，GE加标回收率在94.8%-109.5%之间，相对标准偏差RSD<10%。表明本方法具有较高的精密度和准确度，符合检测方法确认的技术要求。

2.5 实际样品分析

按试验方法对市售的玉米油、大豆油、菜籽油、芝麻油、花生油、葵花籽油、山茶油等样品3-MCPDE、2-MCPDE和GE含量进行测定，具体结果见表6实验结果表明，在424批次植物油中，有170批次检出3-MCPDE、2-MCPDE或GE，检出率为40%。个别玉米油GE限量超欧盟（EU）2018/290号法规的最大限值，极少部分食用油检出高含量2-MCPDE和3-MCPDE，大部分为未检出，总体安全系数较高。

（三）、结论

本试验建立了气相色谱串联质谱法快速测定食品中氯丙醇酯及缩水甘油酯的方法。样品经溴代、水解和衍生后，用气相色谱串联质谱仪测定，同位素内标法定量。该方法操作简便快捷、灵敏度高、结果准确，有效提高检测效率，降低检测成本，适用于植物油中3-MCPDE、2-MCPDE和GE的快速应急处理，为监管部门提供有利的技术支持。

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作者简介：孟奇（1997-），女，河北邢台人，学士，研究方向为食品安全及检测。