摘要：目的：基于肾干-祖细胞探索黄芪益肾方对大鼠肾脏间质纤维化的影响

方法：采用腺嘌呤灌胃法制备慢性肾衰大鼠模型，将健康雄性SD大鼠随机分为 4 组，每组 15 只：对照组、模型组、黄芪益肾方组、氯沙坦钾组。4 周给药后，检测 24h 尿蛋白定量、24h 尿尿酸定量、检测血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）；Masson 染色检测肾脏间质纤维化染色面积；苏木精⁃伊红（HE）染色观察肾脏组织病理变化；免疫组织化学检测肾脏组织中 TGF-β1、FN、分裂增殖标记物 BrdU 和 Pax2、CD133/CD24 双重染色表达。

结果：

1、与对照组比较，模型组大鼠 24h 尿蛋白定量、24h 尿尿酸定量、检测血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、血尿酸（UA）均明显增高 （P<0.05） 。与模型组比较，各治疗组 4 周后 24h 尿蛋白定量、检测血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）均有所减轻 （P<0.05） 。

2、与对照组比较，模型组肾脏病理改变肾小管间质损伤评分及免疫组化 TGF-β1、FN、BrdU、Pax2、CD133/CD24 双重染色表达均有明显增高 （P<0.05 ）。与模型组比较，各治疗组 4 周后，肾脏病理改变肾小管间质损伤评分及免疫组化 TGF-β1、FN 表达均有不同程度降低 （P<0.05） ，BrdU 和 Pax2、CD133/CD24 双重染色表达均不同程度增高 （P<0.05） 。与西药组较，中药组肾脏病理改变肾小管间质损伤评分及免疫组化 TGF-β1、FN 表达均有不同程度降低 （P<0.05） ，BrdU 和 Pax2 、CD133/CD24 双重染色表达无显著差异 _（P>0.05） 。

肾方能促进腺嘌呤灌胃所致慢性肾衰大鼠肾脏内源性干-祖细胞的再生及自身修复能力，减轻 TGF-β1、FN 的表达，减轻肾脏间质纤维化程度，从而达到肾脏保护

关键词： 黄芪益肾方 间质纤维化 肾干-祖细胞

慢性肾脏病（chronickidneydisease，CKD）该病起病隐匿、病程长、疗效差，进展至终末期时，通过肾脏移植或者透析维持生命，给个人及社会造成极大的负担。CKD 进展的病理基础包括肾小球硬化、肾间质纤维化和肾动脉硬化，这些病理改变致纤维化细胞因子过度表达、肾小管上皮细胞表型转化，以及高脂血症、高血压等因素有关。因此，改善 CKD 引起的肾纤维化意义重大。

高艳霞教授在多年治疗慢性肾脏病的临床经验中总结出来的黄芪益肾方，临床随机对照研究可减少慢性肾脏病患者的蛋白尿、延缓肾功能进展。同时经前期课题组研究该方可能通过下调 UUO 大鼠肾组织 TGF-β1、FN 的表达，减轻纤维化，其具体机制尚不明确，因此，此研究通过分析分裂增殖标记物 BrdU 和肾干-祖细胞的表达，探讨黄芪益肾方抗肾间质纤维化的进一步作用机制，为治疗慢性肾脏病所致肾纤维化提供新思路。

1 材料

1.1 动物

正常 SPF 级 SD 健康雄性大鼠 60 只，雄鼠体重 （180±20）g ，由北京华阜生物科级古风有限公司提供，许可证号：SYXK（JIN）2014－0004。

1.2 药品与仪器

黄芪益肾方（黄芪、当归、川芎、赤芍、水蛭等）由山西中医院药房提供，采取成人标准计量 20 倍熬制；氯沙坦钾片由山西省中医院西成药房购买，默沙东制药公司生产，国药准字 H20000371）；腺嘌呤（Adenine，C5H5N5）纯度： >98% ，上海生工生物工程有限公司生产，批号：MC1025B0510J；TGF-β1 抗体购置于 Proteintech，货号：26155-1-AP；FN 抗体购置于 Proteintech，货号： 15613-1-AP；Pax2 抗体购置于 Proteintech，货号：29307-1-AP；CD133 抗体购置于 Proteintech，货号：18470-1-AP；CD24 抗体购置于 SAB，货号：54668；BMP-7 抗体购置于 Bioss，货号：bs-2242R；BrdU 及 BrdU 细胞增殖检测试剂盒购置于自北京普利莱基因技术有限公司，货号：E2059，B3035；

2 方法与检测

2.1 动物模型制作、分组

健康 SD 雄性大鼠 60 只，体重 180g±20g ，于实验室适应性喂养 1 周后予造模，即用腺嘌呤混悬液（ 180mg/kg ）灌胃，1次/d，连续 12d，然后改为 1 次／2d，连续 12d，造模成功后检测肌酐，根据肌酐再次分组。将大鼠随机分为 4 组（每组 15 只）：A 对照组；B 模型组；C 中药（黄芪益肾方）组；D 西药（氯沙坦钾）组;

2.2 给药

中药根据大鼠与成人体表面积换算法计算大鼠的药物临床等效剂量[1]：黄芪益肾方采取成人标准计量 20 倍；氯沙坦钾给药 10.44mg/k_g ，灌胃给药，1 次/d，对照组和模型组灌胃等体积生理盐水灌胃，每日 1 次，连续 4 周。最后 1 次灌胃后 24h，禁食 24 小时，不禁水，留取 24 小时尿液。留取尿标本后，4 组大鼠称定质量后麻醉，腹主动脉采血并分离血清，待处死大鼠后取肾组织左肾上 1/4 放入 4% 多聚甲醛中固定，常温条件下保存。剩余肾组织锡纸包裹标记后置于－80℃冰箱保存。

2.3Masso Π_n 染色

取 4 组大鼠肾组织，用4％多聚甲醛进行固定，经石蜡包埋、切片、按照 M asson剂盒说明染色、脱水、封固切片，最后通过显微镜观察肾脏病理形态，记录蓝色纤维占整个视野的百分比。

2.4HE染色

取 4 组大鼠右侧肾脏，去除包膜和周围脂肪，用4％多聚甲醛进行固定，经脱水、包埋、切片、染色、封片最后镜检合格的样片。在显微镜下观察切片或者浏览数字切片，在不同倍数下详细观察组织切片整体情况，对切片中的基本病理改变如充血、水肿、变性、增生、纤维化、钙化、化生、坏死炎症变化等情况进行文字描述。

2.5 以全自动生化分析仪检测生化及尿液检测

将血液标本于 4^∘C，3000r/m in离心机上离心 15min ，取上清液经生化分析仪进行大鼠 BUN、SCr、UA 水平。取 24h 尿液，使用酶比色法测 24 小时尿蛋白定量。

2.6 免疫组化法测定大鼠肾脏组织中 TGF-β1、FN、分裂增殖标记物 BrdU 和 Pax2、CD133、CD24 及双重染色表达

取 3μm 石蜡包埋肾脏组织切片进行免疫组化分析，经脱蜡复水、封闭，滴加抗体，4℃孵育过夜。在 37^∘C 下与HRP标记的二抗孵育 15min ，DAB显色，苏木素复染，水洗反蓝 5lmin ，脱水透明后，封片，显微镜下观察各细胞因子表达情况。

2.7 统计学处理

使用 SPSS 25.0 统计软件对数据进行分析。本研究所有计量资料均符合正态分布，采用均值±标准差 （λx±s^′） ）表示，组间比较采用单因素方差分析和两两比较，方差齐则采用 LSD 法，方差不齐则采用 Tamhane 检验，计数资料组间比较采用秩和检验。以 P<0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠 24 小时尿蛋白（24hUTP），24 小时尿酸测定结果

治疗后，与对照组相比，模型组、中药组、西药组的 24hUTP，24 小时尿尿酸均明显升高（P<0.01），提示造模后，肾脏明确出现肾脏损伤现象；与模型组比较，中药组、西药组 24hUTP 水平降低（P<0.01 ）；与西药组比较，中药组 24hUTP 水平降低（ P<0.01 ）；各模型组 24 小时尿尿酸测定无明显差异（ P>0.05） （见表 1）

表 1 试验后各组大鼠 24hUTP 指标 （g/L）

注：与对照组比较， *P<0.01 ；与模型组比较，#P<0.01；与西药组比较，△ P<0.01。

3.2 各组大鼠血尿素氮、血肌酐指标

治疗后，与对照组相比，模型组、中药组、西药组的血尿素氮、血肌酐水平均增高（ P<0.05 ），证明造模成功；与模型组比较，中药组、西药组的血尿素氮、血肌酐降低（ P<0.01 ）；与西药组比较，中药组血尿素氮、血肌酐水平降低（ P<0.01 ）。（见表 2）

表 2 各组大鼠治疗后血肾功结果（umol/L）

注：与对照组比较， ^*P<0.05 ；与模型组比较， #P<0.01 ；与西药组比较，△ P<0.01

3.3 各组大鼠肾脏病理学观察及肾间质损伤评分

HE 及 Masson 染色显示，对照组肾脏未见明显病理改变，模型组组肾小管基膜明显增厚，可见部分肾小管萎缩、管腔闭塞或扩张，小管间质内大量炎细胞浸润，间质可见不同程度蓝染面积，网状及多灶状成片间质纤维增生，可见金黄色的嘌呤代谢产物结晶沉积；肾小球可见部分肥大，可视范围内未见明显球性硬化，可见部分少量基质增多及系膜细胞增生，内皮细胞增生；与模型组比较，中药组、西药组的的肾组织视野下病理改变情况较相似，肾间质评分不同程度下降 ⋅P<0.01 ），与西药组比较，中药组肾间质评分水平降低（ P<0.05 ）表 3 图 1（各组 HE 20 染色）。

西药组 中药组

3.4 各组大鼠肾组织 TGF-β1、FN 蛋白表达情况

在对照组肾小球、肾小管、肾间质内几乎不表达 TGF-β1、FN，其他各组 TGF-β1、FN 主要在肾间质有不同程度表达，肾小球表达极少，为黄褐色颗粒状沉积，尤其在模型组 （P<0.01） 与模型组比较，中药组、西药组的 TGF-β1、FN 蛋白表达水平、间质评分不同程度降低（ ）；与西药组比较，中药组 TGF-β1、FN 蛋白表达水平、间质评分降低（ P<0.05） （见表 3、图二）

表 3 各组大鼠、蛋白表达面积、肾小管间质评分 （%）

注：与对照组比较，* P<0.01；与模型组比较，# P<0.01 ；与西药组比较，△ P<0.05。

图二 FN 蛋白

西药组 中药组

3.5 各组大鼠肾组织 BrdU 和 Pax2、CD133、CD24 染色蛋白表达情况

在对照组肾小管、肾间质内可见 BrdU 和 Pax2、CD133/CD24 双重染色蛋白分布较分散，数目较少；模型组术后肾脏出现明显的近端肾小管上皮细胞广泛性坏死，BrdU 和 CD133、CD24 阳性细胞明显增加，主要分布于肾鲍曼囊内，肾小管分布显著高于假手术对照组（ P<0.01 ）。肾皮质 Pax2 阳性细胞分布显著高于假手术对照组（ P<0.01 ）。与模型组相比，中药组、西药组 BrdU 和 CD133/CD24、Pax2 蛋白表达水平均增高（ P<0.05， ），与西药组比较，中药组 BrdU 和 CD133/CD24、Pax2 蛋白表达水平无差别  。（见表 4， 图三）

表 4 各组大鼠肾组织细胞染色平均阳性率 （%）

注：与对照组比较，* P<0.01 ；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与西药组比较，P>0.05；

图三 BrdU 蛋白

对照组 模型组

4 讨论

慢性肾脏病（chronickidneydisease，CKD）是各种原因引起的肾脏结构或功能异常超过 3 个月［2］，最终进展为终末期肾病（end-stagerenaldisease，ESRD），主要表现为肾功能减退，代谢产物潴留，水、电解质及酸碱平衡紊乱等。肾间质纤维化是所有 CKD 进展至终末期肾病（ESRD）的共同病理过程［3］，是纤维化基质的沉积和严重或持续损伤而形成的疤痕[4]，持续的纤维化状态会损害肾脏组织结构和器官功能，是促进疾病进展的一个重要因素。

RIF 的机制较为复杂，多种细胞因子参与RIF 的发生和发展，在RIF 过程中，其中最关键、作用最明显的促纤维化因子是 TGF-β1，RIF 时表达明显增多，它可以促进细胞外基质（ECM）的产生，抑制多种 ECM 蛋白降解酶的活性而抑制 ECM 的降解。此外，它还可增加 ECM 受体表达以促进细胞的黏附。ECM 在肾组织的过度沉积是引起RIF 的主要原因，而 TGF-β1 在肾间质 ECM 的沉积中起主要作用，因而是目前抗纤维化治疗的主要靶目标［5-7］。

近年来很多研究表明肾脏里有两大类细胞拥有再生功能，一类是成熟肾细胞，它们通过不断增生修复损伤；另一类则来自肾脏局部和血液循环中的干细胞，肾脏损伤后可以参与祖细胞及肾小管上皮细胞的再生修复。目前有大量的研究证实在成体肾脏的维持和修复中祖细胞起了很大的作用[8]，通过增殖能力、分化潜能等机制参与了肾损伤后的修复和再生过程。2006 年，Sagrinati[9-10]等又从鲍曼氏囊内分离出 CD24+CD133+细胞，该细胞具有类似肾干细胞形成集落的潜能，体外培养可形成肾小管上皮细胞和足细胞，是足细胞和肾小管上皮细胞的共同祖细胞，即肾祖细胞（renalprogenitorcell，RPC） ） RonconiE[11]等人进一步发现鲍曼氏囊内 CD24+CD133+细胞其实包含两种细胞，即 CD24+CD133+PDX+细胞和 CD24+CD133+PDX-细胞，前者位于肾小球血管极（vascularpole，VP），只能分化为足细胞，是足细胞的前体细胞，后者位于肾小球尿极（urinarypole，UP），可分化为足细胞和肾小管上皮细胞，是其共同祖细胞。

5-溴 2-脱氧尿嘧啶核苷（5-brom02-deoxyuri-dine，BrdU）是 DNA 前体胸腺嘧啶核苷的类似物，能选择性的掺入到处于细胞周期 S 期（即 DNA 合成期）细胞的单链 DNA 核苷酸序列中[12]在活体引用合成DNA的可示踪的前体物质BrdU使增殖期细胞可竞争性的替代胸腺嘧啶而掺人成为细胞增殖的重要标志。掺人合成的强度可直接显示细胞增殖的能力，再取其相应组织制作切片，应用与 BrdU 特异反应的单克隆抗体，对已完成了 BrdU 标记的正常或病理状态下细胞的 DNA 复制进行免疫组织化学检测，并可进行定位观察和统计学分析[13-14]。

慢性肾脏病可归属于祖国医学“水肿”、“尿浊”“虚劳”等范畴，晚期五脏六腑均可受累，现代中医认为关键是正虚邪实，以脾肾衰败为本虚，标实则为湿、热、瘀、浊互结。高艳霞主任在此基础上研究认为，慢性肾脏病瘀血症状日益加重，常在血瘀基础上形成结块，阻滞脉络，这与西医所述肾脏病后期肾实质纤维化、肾小球硬化相吻合[15]。高艳霞主任在临床中从健脾益肾，化浊祛瘀为出发点，拟经验方黄芪益肾方，治疗效果显著。方中黄芪为君药，具有健脾益气之效，补后天而养先天。当归、川芎为臣药，当归补血活血，作为补血要药，与川芎共用，具有养血补血、活血化瘀功效。蒲公英性苦寒，具有清热泻火，利湿解毒功效，使湿热能去。六月雪味淡、微辛、性凉具有疏风解表，清热利湿，舒筋活络等功效。清风藤具有祛风除湿，利尿消肿之效。石韦具有温补脾肾、健脾利湿之功效。以上诸药为佐药，共助活血化瘀、利湿清热之效。配以甘草以调和诸药，为使药。

本研究腺嘌呤灌胃法制备慢性肾衰大鼠模型后，模型组，肾小管管腔及间质可见明显针状褐色结晶，肾小管广泛扩张，大量萎缩消失，管腔内可见管形，肾间质增宽，间质内有胶原纤维增生及大量炎症细胞浸润，肾小球可见囊壁增厚，轻度系膜增生，细胞数增多。监测所有模型组术后，血肌酐、尿素氮及 24h 尿蛋白、RIF 程度、BrdU 和 Pax2、CD133/CD24 阳性表达面积均较对照组增高，提示肾损伤模型的成功，以及肾脏髓质之中的细胞已经出现增殖现象。而以 Pax2、CD133/CD24 阳性细胞的表达，说明受损后肾脏鲍曼氏囊内的肾祖-干细胞在增殖，其是足细胞和肾小管上皮细胞的共同祖细胞，参与其再生修复。给予西药及中药干预后，其表达均不同程度的增高，说明药物对其增殖细胞的促进作用。结合进一步分析各组间质纤维化指数以及大鼠肾组织 TGF-β1、FN 蛋白表达情况，模型组与治疗组比较，大鼠病理改变间质纤维化程度及 TGF-β1、FN 蛋白表达均减轻，治疗组组间比较无明显差异。进而推断黄芪益肾方能促进腺嘌呤灌胃所致慢性肾衰大鼠肾脏内源性干-祖细胞的再生及自身修复能力，减轻 TGF-β1、FN 的表达，减轻肾脏损伤，延缓纤维化进程，延缓肾功能损伤相关。

参考文献

[1]邓文龙.动物中人体剂量换算遵循的原则[J].中药药理与临床，2016，32（3）：19

[2]葛均波，徐永健.内科学[M].北京：人民卫生出版社，2013：525

[3]MICHAELZEISBERG，ERICGNEILSON.MechanismsofTubulointerstitialFibrosis[J].Journalofthe AmericanSocietyofNephrology：Jasn，2010，21（11）：1819-1834

[4]HUMPHREYS B D.Mechanisms of renal fibrosis[J].Annu Rev Physiol，2018，80：309.

[5]李才.器官纤维化基础与临床.北京：人民卫生出版社，2006.97.

[6]刘艳红，韩子明.单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的发生机制.国际泌尿系统杂志，2010，30（5）：600-603

[7]GagliardiniE，BenigniA.Roleofanti-TGF-betaantibodiesinthetreatmentofrenalinjury.CytokineGrowth FactorRev.2006.17（1-2）：89-96

[8]刘喜红，易著文.干细胞/祖细胞对肾脏的再生修复作用研究进展[J].中华儿科杂志，2005（11）：30-32.

[9]SagrinatiC，NettiGS，MazzinghiB，etal.Isolationandcharacterizationofmultipotentprogenitorcellsfromth eBowman’scapsuleofadulthumankidneys[J].JamSocNephrol2006，17：2443-2456.

[10]GuptaS，VerfaillieC，ChmielewskiD，etal.Isolationandcharacterizationofkidney-derivedstemcells[J].Ja mSocNephrol，2006，17：3028-3040.

[11]ElisaRonconi，CostanzaSagrinati，MariaLuciaAngelotti.etal.RegenerationofGlomerularPodocytesbyH umanRenalProgenitors[J].JAmSocNephrol，2009，20：322-332.

[12]黄文孝，肖红俊，汪吉宝，等.用 BrdU 标记技术观察大鼠内淋巴囊的 S 期细胞[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2002，Il（4）：4003.

[13]宋治远，钟理，乳鼠窦房结细胞的原代培养与鉴定[J]临床心血管病杂志，2002，18（9）：447.

[14]李红华，汪月增，楼方定，等.流式细胞仪 BrdU/DNA 双参数分析测定急性白血病细胞周期及其临床意义[J].解放军医学杂志，2002，27（10）：913.

[15]李松伟，高艳霞.高艳霞治疗慢性肾脏病 3、4 期的中医诊疗思路[J].中国民间疗法，2018，26（06）：6-7.

基金项目：山西省中医药管理局资助课题 2023ZYYDA2016