打开文本图片集

摘要：目的：近年来在卵巢癌中发现了几种具有不同预后的分子亚型。然而，在卵巢癌中尚未充分研究转移相关基因分子亚型分析。方法：差异分析获取转移相关预后基因，根据表达水平对卵巢癌患者进行聚类分析，以获得聚类分型。采用LASSO-Cox回归分析建立预后风险模型，计算风险评分，并探讨预后风险模型的临床价值。结果：鉴定出58个预后基因，根据其表达水平对TCGA数据集进行聚类分析结果可得为2个分型，具有不同的预后。使用LASSO回归构建含个30基因的预后模型，对多个数据集预后具有较好预测。结果：该预后模型对卵巢癌患者的预后具有较好预测作用。

关键词：转移；卵巢癌；分子亚型；预后。

卵巢癌（oc）是妇科最普遍的恶性肿瘤之一，且死亡率最高[1]。2020年，全球约313，959例新发病例和207252例死亡病例，且发病率、死亡率被预测呈上升趋势[2]。卵巢癌早期常表现为腹部不适、恶心、腹胀，常常被误以为胃肠道疾病而被忽视[3]，多数OC患者被诊断时即为晚期，且具有广泛转移。肿瘤转移与预后不良密切相关，也是卵巢癌患者死亡的主要原因。因此，探索新的生物标志物来抑制肿瘤转移至关重要。

1.材料和方法

1.1 OC 数据集和预处理

具有完整临床信息注释的开放卵巢癌基因表达数据集从公共数据库Gene Expression Omnibus（GEO）和TCGA下载。

1.2 转移相关基因的获取

在GSE178913、GSE143897数据集中使用limma包[4]进行差异基因分析，以调整P值<0.01，|logFC|>1为标准筛选差异基因，两者取交集获取相同基因，对其进行单因素Cox分析，P值取0.05，共筛选出个58个影响预后基因。

1.3 转移相关基因的无监督聚类

根据这58个基因的表达水平，使用具有最优k均值聚类的ConsensusClusterPlus R包[5]将对TCGA数据集进行聚类分析，并循环了1000次以确保分类的稳定性，最终确定了两亚型，同时进一步对GSE9891队列进行聚类分析，同样确定了两亚组，证明其聚类可重复性，并使用Kaplan-Meier方法计算不同亚组之间的总生存期（OS）分析。

1.4 功能和途径富集分析

从MSigDB数据库下载了“c2.cp.kegg.v2023.1.Hs.symbols”的基因集，以运行GSVA富集分析[6]，以确定分析两亚组之间生物学功能差异的不同途径。

1.5 与转移基因亚型相关的差异表达基因

两亚组之间的差异表达基因（DEGs）采用limma R包的经验贝叶斯方法鉴定，以调整P值<0.01，|logFC|>1为标准筛选差异基因。

1.6 预后模型的建立

使用Lasso Cox回归模型[7]筛选出30个转移相关基因以确定最佳预测模型，并选择这些基因进一步计算每个患者的风险评分。

根据评分的平均值，将TCGA样本分为高低转移评分组。然后使用survminer R包对两组进行生存分析。最后，利用timeROC曲线进行分析，获取曲线下面积（AUC）值，评价特征的预测能力。计算GSE9891及GSE140082数据集的化疗评分，并用timeROC曲线评价特征的预测能力。

1.7统计学

用对数秩和卡普兰-迈耶检验绘制生存曲线。95%置信区间（CI）和风险比（HR）使用单变量Cox回归模型计算。在组间比较中，P<0.05被认为具有统计学意义。R 4.3.1软件用于数据处理。

2.结果

2.1 卵巢癌中的转移相关亚型

分别对GSE178913、GSE143897数据集中转移灶与原位灶使用limma包进行差异基因分析，两者取交集共获得814个共同基因（图1.A）。GO分析提示多与细胞连接、上皮形态发生、细胞功能划分相关等细胞基质相关生物活动（图1.B），TCGA卵巢癌数据集进行单因素Cox回归分析，获得了58个影响预后基因。根据58个基因表达水平对数据集进行无监督聚类分析，确定了两种亚组（A-B）（图1.C），Kaplan-Meier生存分析表明两组间存在明显差异（图1.E），A组在中位生存时间方面表现出显著优势。使用“共识聚类”R包对GSE9891进行无监督聚类分析以明确聚类稳定性，并再次明确确定了两亚组（图1.E），这两亚组的生存率同样存在显著差异（图1.F）。

转移基因与转移亚型分组。（A）两数据集差异基因韦恩图。（B）转移基因GO分析。 （C）TCGA数据集的聚类分析。（D）TCGA数据集两亚组间生存分析。（E）GSE9891数据集的聚类分析 （F）GSE9891聚类亚组间生存分析。

2.2化疗亚组生物学功能差异

为了更好地了解两亚组之间的生物学差异。首先对亚组进行GSVA富集分析，以检查其功能和生物学差异。结果表明，A组主要与错配修复、DNA修复、碱基切除修复相关，B组主要与基质受体作用受体、 焦点粘附、细胞黏附分子。A组主要与DNA修复相关，抑制癌变，B组主要与细胞基质相关，细胞基质与肿瘤进展、侵袭、化疗抵抗密切相关，因此A组较B组具有更好的预后（图2.A）。采用limma R包鉴定两亚组间差异基因（DEGs），共获得256个基因（图3.A）。DEGs就GO分析提示细胞基质活动，KEGG分析则表明多富集于细胞基质相关通路，进一步确认聚类亚组与转移密切相关。

化疗亚组分组的生物学功能。（A）两亚组间生物学差异。（B）亚组间差异基因GO分析（C）亚组间差异基因KEGG分析.

2.3预后模型的建立与验证

对TCGA数据集患者采用LASSO Cox回归法确定λ的最优值，鉴定出30个关键基因（图3.A.B）。然后根据30个关键基因的表达建立转移相关预后模型，并将其定义为转移评分，将患者的转移评分以中位数为标准分为高分组与低分组，Kaplan-Meier生存曲线显示两组间存在差异显著（图3.C），高评分组的生存率低于低评分组，同时TimeRoc曲线表明转移评分对患者预后具有可较好的预测（图3.D）。转移评分与其他临床因素进行单因素及多因素分析表示转移评分、年龄及残余病灶大小可作为卵巢癌的独立预后因素（图3.E）在GSE9891数据集中，转移评分也可对患者预后进行可较好的评价（图3.F）。

预后模型的建立与验证。（A）通过交叉验证选择LASSO 回归的最优参数λ（B）根据最优参数（λ）建立的含30个基因的预后模型。（C）高低转移评分组的生存分析。（D）预后模型对1至5年生存率的预测。（E）转移评分与其他临床因素的森林。（F）预后模型对GSE9891数据集中患者1至5年生存率的预测。

3.讨论

卵巢癌是女性生殖道普遍存在的恶性肿瘤，大多数患者诊断是已为晚期诊断，因此5年生存率极低。目前，OC的推荐治疗方法是手术联合铂类药物、紫杉醇化疗，大多数患者最初在化疗后会出现临床完全缓解，约有30%～40%的少数患者在接受治疗后仍会出现不完全缓解或疾病进展，但大多数患者最终会复发并伴有远处转移[14]。

对转移相关基因进行GO、KEGG分析，提示转移多与细胞基质相关。对TCGA样本就影响预后的转移基因进行无监督聚类分析，可分为两亚型。对两亚型进行通路分析，一亚组主要与DNA修复相关，抑制癌变，具有较好预后，另一亚型则多富集于细胞基质通路，预后较差。考虑转移相关基因对OC异质性及相应临床结局的影响，构建了包含30个基因的模型，以量化转移评分。评分低的患者比转移评分高的患者生存率更高，作为卵巢癌患者的独立预后生物标志物，多个数据集验证后表明对卵巢癌患者的预后具有一定的预测能力。

该研究是基于公开数据的回顾性研究，生物标志物的临床应用需要更多样本的数据支持。

参考文献

[1] Siegel， R.L.， Miller， K.D. and Jemal， A. ‘Cancer statistics， 2018’， CA： A Cancer Journal for Clinicians， 68（1）， pp. 7–30. doi：10.3322/caac.21442.

[2] Sung， H. et al. ‘Global cancer statistics 2020： Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries’， CA： A Cancer Journal for Clinicians， 71（3）， pp. 209–249. doi：10.3322/caac.21660.

[3] Smith， L.H. et al. ‘Ovarian cancer： Can we make the clinical diagnosis earlier？’， Cancer， 104（7）， pp. 1398–1407. doi：10.1002/cncr.21310.

[4] Ritchie ME， Phipson B， Wu D. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43（7）：e47. doi： 10.1093/nar/gkv007.

[5] Wilkerson， M.D. and Hayes， D.N.‘ConsensusClusterPlus： A class discovery tool with confidence assessments and item tracking’， Bioinformatics， 26（12）， pp. 1572–1573. doi：10.1093/bioinformatics/btq170.

[6] Hänzelmann， S.， Castelo， R. and Guinney， J. ‘GSVA： Gene set variation analysis for microarray and RNA-Seq Data’， BMC Bioinformatics， 14（1）. doi：10.1186/1471-2105-14-7.

[7 ]Gao， J.， Kwan， P.W. and Shi， D. ‘Sparse kernel learning with LASSO and bayesian inference algorithm’， Neural Networks， 23（2）， pp. 257–264. doi：10.1016/j.neunet.2009.07.001.

[8] Bookman， M. A.， Okamoto， A.， Stuart， G. Harmonising clinical trials within the Gynecologic Cancer InterGroup： consensus and unmet needs from the Fifth Ovarian Cancer Consensus Conference. Annals of oncology ： official journal of the European Society for Medical Oncology， 28（suppl_8）， viii30–viii35.

作者简介：朱顺鹏，男，安徽滁州，苏州大学附属第一医院妇产科研究生在读，研究方向为妇科肿瘤