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前言

葛根的主要有效成分是以葛根素、大豆苷、大豆苷元为代表的异黄酮类化合物，其中葛根素（puerarin）又称二羟基异黄酮，其结构与雌二醇相似，具有部分雌激素样作用。葛根素的含量常被作为评价葛根质量的主要指标。

本实验选用了Fe-MOF来作为装载GOx的载体，Fe-MOF具有优异的类辣根过氧化物酶活性、极高的稳定性、高生物相容性，且合成相对便利[23]。通过将GOx整合到Fe-MOF上，建立了一个典型的级联反应。具体来说，GOx首先催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和H2O2，随后Fe-MOF迅速催化H2O2产生·OH，它将继续催化氧化显色底物葛根素（弱荧光）形成二聚体产物（强荧光），该产物在315 nm的激发光下能发射波长为478 nm的强荧光，并且反应体系荧光强度增加与葛根素的量在一定浓度范围内呈线性相关，在葡萄糖过量的情况下，产生的过氧化氢相应过量，由于加入检测样品葛根素含量的不同，所显现的颜色变化和溶液荧光强度呈现规律。利用上述新型金属有机框架材GOx@Fe-MOF构建的级联比色传感器，得到葛根素含量与级联反应结束后溶液荧光强度的函数关系，以此实现高效便捷环保地检测葛根素。

第1章 级联比色传感器的建立与实验

1.1 GOx@Fe-MOF的制备

将0.1 mL的EDC（20 mmol·L-1）和2 mL的GOx（5 mg·mL-1）溶液混合，在室温下轻轻振荡15 min，得到溶液A。然后将0.1 mL的NHS（20 mmol·L-1）和10 mL的Fe-MOF（1 mg·mL-1）溶液混合，并在溶液A中浸泡2 h，得到溶液B。最后将溶液B在10000 rpm，5 min的条件下离心，得到GOx@Fe-MOF，将离心得到的GOx@Fe-MOF加入到10 mL去离子水中备用。

第2章 实验结果展示及分析

2.1 材料的表征

2.1.1红外光谱表征

从Fe-MOF的红外谱图可以看到所出现的特征吸收峰分别为2365 cm-1、1590 cm-1、1492 cm-1、1415 cm-1、1143 cm-1、904 cm-1 和737cm-1，而这些吸收峰主要是由羧酸盐振动所引起的。1492 cm-1、1415 cm-1和1143 cm-1处分别是对苯二甲酸的羧基中 C=O 的不对称振动吸收峰和对称振动吸收峰，737cm-1处是苯环的 C-H 弯曲振动峰。特征峰与文献中报道一致，表明金属有机框架纳米材料Fe-MOF合成成功。

从GOx@Fe-MOF的红外谱图可以看到所出现的特征吸收峰分别为3395 cm-1、2343 cm-1、1595 cm-1、1492 cm-1、1418 cm-1、1148 cm-1 和744cm-1，而这些吸收峰主要是由羧酸盐振动所引起的。1492 cm-1、1418 cm-1和1148 cm-1处分别是对苯二甲酸的羧基中C=O的不对称振动吸收峰和对称振动吸收峰，744cm-1处是苯环的C-H弯曲振动峰。并可以观察到在3000 cm-1 -3500 cm-1处有GOx的特征吸收曲线。特征峰3395 cm-1与文献中报道基本一致，表明金属有机框架纳米材料GOx@Fe-MOF合成成功

2.1.2 扫描电子显微镜的表征

采用扫描电子显微镜表征所制备的Fe-MOF颗粒的形态和晶体尺寸，观察到均匀八面体结构，粒径约为341-396 nm。采用扫描电子显微镜表征所制备的GOx@Fe-MOF颗粒的形态和晶体尺寸，观察到相比Fe-MOF颗粒颜色更深的均匀八面体结构，粒径约为341-396 nm。

2.2 实验可行性验证

2.2.1 显色底物葛根素的荧光特性验证

对葛根素-类辣根过氧化物酶-过氧化氢反应体系的荧光特性进行了研究。

1号孔位中含有完整的级联比色反应体系，并以葛根素作为显色底物。2号孔位中不外加显色底物葛根素。两支试管在室温下分别测定其在315 nm处的荧光激发光谱。加入葛根素的一组产生了明显的荧光强度变化，说明级联反应中显色底物葛根素（弱荧光）被催化氧化形成二聚体产物（强荧光），验证了葛根素作为显色底物的可行性。

2.2.2 GOx@Fe-MOF类辣根过氧化物酶活性验证

1号孔位中含有完整的级联比色反应体系，并以GOx@Fe-MOF作为类辣根过氧化物酶进行催化氧化。2号试管中不另外加酶，作为空白对照组。在室温下分别测定两组溶液在315 nm的激发波长下发射波长为478 nm处的荧光强度，并重复三次，取平均值。1号试管的平均相对荧光强度为26.49 RFU，标准差为1.185，2号试管的相对荧光强度为6.048 RFU，标准差为0.726。实验证明GOx@Fe-MOF具有较强的类辣根过氧化物酶活性，可以级联催化氧化葡萄糖和和葛根素，使葛根素被氧化生成具有强荧光特性的二聚体产物。

2.2.3 GOx@Fe-MOF酶活性优越性验证

2.2.3.1 GOx@Fe MOF与HRP对照

三组孔位分别在加入葡萄糖及显色底物葛根素的基础上加入HRP、GOx@Fe-MOF、去离子水（空白对照）。实验可知GOx@Fe-MOF具有强于辣根过氧化物酶的优越性。通过将GOx整合到Fe-MOF上，建立了一个典型的级联反应。具体来说，GOx首先催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和H2O2。然后，Fe-MOF迅速催化H2O2产生·OH，它将继续氧化葛根素生成强荧光特性的二聚体产物。该金属纳米酶缩短了反应物间距，使得氧化反应更加高效。

2.2.3.2 GOx@Fe MOF与游离GOx＋Fe-MOF对照

三组孔位分别在加入葡萄糖及显色底物葛根素的基础上加入GOx@Fe-MOF、游离的GOx和Fe-MOF、去离子水（空白对照）。实验结果证明金属框架纳米酶GOx@Fe-MOF相较于游离的GOx和Fe-MOF催化氧化葛根素的效果更好，生成了更多的二聚体产物，激发了更大的荧光强度。更进一步证明了金属框架纳米材料GOx@Fe-MOF以葛根素为底物的级联比色传感反应器的优越性。

2.3 反应条件优化

2.3.1 pH值对反应的影响

实验结果显示了不同pH对荧光强度的影响。12组溶液分别代表级联反应体系位于pH为1-12的环境中，测定不同pH下反应液在315 nm激发波长下的的荧光光谱。结果显示，反应液在pH 8的弱碱性环境下荧光强度最大，pH 7的中性环境下次之，在其他偏酸或偏碱性环境下荧光强度均较低。说明该金属纳米框架材料GOx@Fe-MOF适合在中性或弱碱性条件下反应。

2.3.2 温度对反应的影响

实验结果显示了不同温度对荧光强度的影响。分别测定三次不同温度下反应体系在315 nm激发波长在478 nm发射波长处的荧光强度，并取平均值。结果显示，最佳反应温度为40℃，而后趋于饱和。在40℃前温度越高荧光强度越高，这与酶的特性相符合。

2.4 标准曲线的构建

2.4.1 利用级联比色传感器检测葛根素浓度的标准曲线

用荧光光度计检测不同混合液在激发波长为315 nm、发射波长为478 nm处的荧光强度，以葛根素标准液浓度（μg/mL）为横坐标，荧光强度为纵坐标，分析葛根素浓度与荧光强度之间的线性关系并建立线性回归方程。

2.4.2 线性回归方程的建立

代入所得数据，绘制线性趋势线，建立线性回归方程，得到公式：

y = 526x + 1512.3

其中R2 = 0.9994

线性回归方程中x为葛根素浓度（mg/mL），y为荧光强度（a.u.）。

结果表明在新型金属有机框架纳米材料GOx@Fe-MOF的级联比色传感器检测葛根素中，葛根素浓度与荧光强度呈正相关。

2.5 实际样品检测

2.5.1 检测方法

供试品溶液：葛根药材粉末（过三号筛）约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%甲醇溶液50 mL，称定重量，超声30 min，放冷，再称定重量，用30%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

移取30 μL供试品溶液、30 μL GOx@Fe-MOF（1 mg﹒mL-1）和30 μL葡萄糖溶液（1 mM）于96孔板中，加入1μL NaOH溶液将pH调至微碱性。将96孔板放进酶标仪内，将酶标仪温度设定为50℃，检测待测液液在激发波长为315nm、发射波长为478nm处的荧光强度。将测得的荧光强度代入回归方程中，计算葛根素药材粉末中的葛根素浓度，进行三次平行实验。

2.5.2 检测结果

2.5.3 结果讨论

在反应条件优化实验得到的最优反应条件下，进行三次重复试验，测定并计算浓度。由表2-1中的数据可知新型金属有机框架纳米材料GOx@Fe-MOF的级联比色传感器在检测葛根素中的条件的稳定性、重现性良好，且本课题方法与结果达到预期

2.6 材料的合成条件的优化

如图所示，7个点分别代表了20 mg的Fe-MOF与5、10、15、20、25、30、35（mg）的GOx相合成GOx@Fe-MOF后参与级联比色反应，反应液荧光强度数值对比。由图可知当加入GOx的量为30 mg时，催化氧化葛根素效果最好，此时合成条件达到最佳，而后趋于饱和，这是由于金属有机框架材料Fe-MOF上的结合位点趋于饱和。因此最佳合成质量比为Fe-MOF：GOx = 2：3。

第3章 总结与展望

本实验成功制备了金属有机框架纳米材料GOx@Fe-MOF，构建了用于检测葛根素的GOx@Fe-MOF的级联比色传感器。建立了葛根素含量计算的线性方程y = 526x + 1512.3（R2 = 0.9994），并对葛根素供试品检测完成检测。同时进行了反应和合成条件优化，探索出了最适宜的反应条件与合成条件，实验方案完备，结果符合预期。