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【摘要】目的 探讨中药对铝染毒小鼠脑组织β分泌酶及其他相关酶的影响方法用铝水溶液拌饲料喂养小白鼠90天，然后分成三组，治1组，治2组，不治疗组即模型组，另设1组喂正常饲料的正常组. 治1组、治2组90天后分别灌二种不同的中药15天，结束实验，取血，取脑作10%脑匀浆测定。测定实验前、后的血红蛋白、水迷宫遊水时间。结果治1组、治2组、模型组、正常组依次排列，脑乙酰胆碱酯酶（AchE）活力分别是2.49±0.67▲▲、2.29±0.52▲、1.60±0.38、2.35±0.57▲（ U/mg.prot ），▲P<0.05，▲▲P<0.01 ， 差异有统计学意义; 脑乙酰胆碱转移酶（chAT）活力分别是116.91±27.08、118.55±29.26、109.64±24.88、116.73±24.66 （ U/g组织湿重），差异无统计学意义; β-位淀粉样前体蛋白裂解酶1（BACE1） 活力分别是45.42±2.29、42.00±3.12★、40.17±2.51★★、39.82±2.42★★（ U/L），与治1组比较， ★P<0.05， ★★P<0.01 ，差异有统计学意义; 水迷宫时间，组间比较无显著性差异，组内前后比较，造模后治疗后时间均显著性延长;错误率、失败率增加，以模型组失败率增加最明显;造模前、治疗后血红蛋白（Hb）比较组间、前后均无明显变化。结论 实验表明 ，铝染毒对（BACE1） 活力影响不明显，但对乙酰胆碱酯酶（AchE）活力影响明显。治1组（BACE1） 活力明显升高，有待进一步研究。

【关键词】 铝;老年痴呆症;乙酰胆碱酯酶;β分泌酶（β-位淀粉样前体蛋白裂解酶1，BACE1）

[中图分类号]：R955                  [文献标识码]：A

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常见的一种渐进性中枢神经系统退行性疾病，病因未明，机理复杂，其两个主要病理特征为细胞外 β 淀粉样肽（β-amyloid，Aβ） 沉积形成老年斑（senile plaques）和细胞内 Tau 蛋白过度磷酸化形成神经纤维缠 结（neurofibrillary tangles）[1]。本文利用铝给小鼠建立老年痴呆症[2]，模型，用首乌和海尔福治疗，测定脑β-位淀粉样前体蛋白裂解酶1（BACE1），乙酰胆碱酯酶（AchE）活力等，探讨疗效及机理，现将结果报道如下。

1  材料与方法

1.1  材料

试剂  氯化铝，、高铁氰化钾、盐酸（HCL）、均为国产分析纯。各种测试盒，乙酰胆碱酯酶（AchE）测

试盒、乙酰胆碱转移酶（chAT）测试盒，尿素氮测试盒、甘油三酯（TG）测试盒、总胆固醇（TC）测试盒、谷丙转氨酶测试盒，购自南京建成生物工程研究所科技有限责任公司。β-分泌酶1（蛋白裂解酶1，BACE1）测试盒购自上海江莱生物有限责任公司。

1.2中药  何首乌（生），购自本市市场，原产本地农村，经炮制成制首乌干品，。其他中药干品，购自市向阳中药店， 自提。经加热水提取，乙醇沉，去沉淀，去乙醇，制成口服水溶液。首乌，桂园复方口服液，由制首乌，龙眼肉组成;海尔福口服液由金银花、茯苓、甘草、绿豆等组成;

1.2  实验方法

1.2.1 动物，小白鼠40只，昆明种，健康，全部雌性，鼠龄2个月。由学院动物室提供（动物使用许可证号：SYXK桂2011-0010。动物生产许可证号：SCXK桂2012-0003.）.

1.2.2动物实验 分笼喂养，每笼5只，分四组，每组10只（2笼），即治1组，治2组，模型组，正常组;前三组造模， 用氯化铝造模，用17.8g/L氯化铝水溶液（剂量，1ml/只）拌饲料喂养，饲料为标准饲料，由学校动物室提供， 每只小鼠每天饲料6g。每日加饲料拌药一次，吃完（吃不完时适当减少饲料， 药不减），连续90天;之后，治1组用首乌，桂园复方口服液灌胃，剂量0.12ml/只原液，蒸馏水稀释至0.3ml; 治2组用海尔福口服液灌胃，剂量0.10ml/只原液，蒸馏水稀释至0.3ml; 模型组，正常组用等量蒸馏水（0.3ml/只）代替灌胃，连续15天结束治疗.做实验前、治疗前、治疗后水迷宫测定;实验前、治疗后血红蛋白Hb测定;结束实验2天，从眼球后取血、分离血清放普通冰箱，测定生化指标;取肝肾器官，放甲醛浸泡，作病理检查;取大脑，制成10%脑匀浆。

1.2.3  Y型水迷宫实验  利用Y型水迷宫，测定小鼠记忆力，测试方法按参考文献[6]。开始预先训练8-10天（d），每天游水训练3次，使其熟悉上岸地点. 训练结束，休息一天后测试： 计时， 连续3天，每天3次，计算自下水至到达上岸地点的时间（s）和错误次数（走错线路，计算错误率%），超过40秒/次，或不按规定点上岸，算失败（计算失败率%）， 超过10秒/次，算超时，（计算超时率%）。

1.2.4血红蛋白Hb测定，取小鼠尾巴全血20ul，用高铁氰化钾（HiCN法）测定，具体操作参考文献[5]。实验结束， 从眼球后取全血，分离血清， 测定生化指标： 尿素氮、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、谷丙转氨酶（ALT）、总蛋白。处死小鼠，取大脑组织，在冰浴下用玻璃匀浆器研磨，用生理盐水制成10%脑匀浆，3000rpm离心10min，取上清放4-8度冰箱保存待用.分别测定AchE、chAT、BACE1：血清ALT用改良赖氏法测定;Tc用COD-CE-PAP测定;TG用GPO-OAO法测定;尿素氮用脲酶波氏法测定;AchE根据乙酰胆碱在AchE催化下产生乙酸和胆碱，胆碱再与巯基显色剂作用产生黄色化合物TNB（对称三硝基苯），比色测定;具体操作按试剂盒说明书;铝含量，用氟电极法测定;乙酰胆碱转移酶（chAT）测定是以乙酰辅酶A和胆碱为底物，在chAT催化下，反应的生成物与显色剂结合，在324nm处有吸收峰，以此测定并计算chAT活力，具体操作按试剂盒说明书。β-分泌酶1测试采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。按试剂盒说明书操作。

1.3  统计学处理  数据用SPSS-13软件处理，进行方差分析和Q检验，结果用（±s）表示。

2.结果

2.1实验前、后小鼠血红蛋白（Hb）含量测定结果。 结果显示，组间比较， 造模前小鼠血红蛋白（Hb） 各组间差异无统计学意义。治疗后， 各组间差异无统计学意义;    见表1。

方差分析：造模前血红蛋白Hb，各组间比较， F=0.034，p=0.991 差异无统计学意意义。治疗后Hb： F=1.163，p=0.338 差异无统计学意意义。

组内比较： 前、后， 各组： 实验前后比较， 差异无统计学意义;

2.2 血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、尿素氮含量测定结果。结果显示， TG， 各组间比较， 差异有统计学意义; （TC） ， 各组间比较，差异有统计学意义; 尿素氮，各组间比较，差异有统计学意义。见表2.

2.3血清谷丙转氨酶（ALP）、血清总蛋白、脑匀浆蛋白含量测定结果。 结果显示， 血清谷丙转氨酶（ALP）、各组间差异无统计学意义; 血清总蛋白含量，各组比较，有明显差异。脑匀浆蛋白，各组比较，有明显差异。见表3.

2.4 造模前、造模后（治疗前）、治疗后水迷宫时间。 结果显示，造模前、造模后（治疗前）、各组间无明显差异，治疗后水迷宫时间.各组间差异有统计学意义，有明显差异; 前中后均有明显变化，， 造模后，治疗后时间延长。见表4.

方差分析：组间比较： 造模前：F=0.643，P=0.592， 差异无统计学意义; 造模后（治疗前）： F=0.868， P=0.466， 差异无统计学意义;治疗后： F=2.943，P=0.045， 与正常组比较， ▲P<0.05， 差异有统计学意义。

组内比较： 各组间前中后比较，差异有统计学意义; 治1组前中后比较， F=4.806，P=0.015，

与造模前比较， a P<0.05， 差异有统计学意义; 治2组前中后比较， F=3.192，P=0.055， 与造模前比较， bP<0.05， 差异有统计学意义; 模型组前中后比较， F=5.026，P=0.014， 与造模前比较， cP<0.01， 差异有统计学意义; 正常组前中后比较， F=6.055，P=0.007， 与造模前比较， dP<0.01， 差异有统计学意义;

分析： 造模前各组均无错误和失败; 造模后各组均有错误， 除正常组无失败外， 造模三组均有失败; 治疗后仅有模型组有较高的失败率，其余三组均无失败率%;各组造模后错误率%和失败率%都较高，说明记忆功能下降，但正常组虽出现较高错误率%，但没有失败，说明记忆功能下降较轻; 治疗后模型组错误率%和失败率%都较高，说明记忆功能下降比其余三组明显，治疗组治疗后有一定恢复。

2.5脑乙酰胆碱酯酶（AchE）活力、脑乙酰胆碱转移酶（chAT）活力、β-位淀粉样前体蛋白裂解酶1（BACE1） 活力测定结果。结果显示，模型组（AchE）活力明显低于其他组; （chAT）活力， 差异无统计学意义;（BACE1） 活力， 治疗1组明显高于其他组。 见表6.

2.5实验前后体重变化。见表7

3.讨论

3.1阿尔茨海默病，又称老年痴呆症（AD），是痴呆中最常见的一种痴呆形式，占老年 痴呆病人的 60% ～ 80%〔1〕 ，主要表现为进行性记忆 力和认知功能下降..  AD 的标志性病理特征包括脑细胞外淀粉样蛋白（-amyloid protein，A）沉积 形成老年斑、Tau 蛋白过度磷酸化导致的细胞内神经纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT）、神经元丢失和突触功能障碍;神经炎症增加以及神经元凋亡。其中，A沉积和 Tau 蛋白过度磷酸化可能是神经元损伤和破坏的起点〔3〕。有研究发现，在细胞外液，Aβ 可由星形胶质细胞分泌的蛋白酶降解，也能被神经元或胶质细胞（包括吞噬性小胶质细胞和星形胶质细胞）摄取降解，或者由细胞外液输送到血液或淋巴液等。 Aβ 从产生到聚集、沉积成为病理性淀粉样斑块的过程中有众多影响因素。病理性斑块周围常可见大量炎性细胞（包括小胶质细胞和星形胶质细胞）聚集，提示 Aβ 沉积可能与炎性反应相关。同时，小胶质细胞和星形胶质细胞也参与 Aβ 的分解代谢，与AD的发生发展密不可分。

另有研究表明，β 淀粉样前体蛋白（APP）的翻译后修 饰异常是影响 APP 代谢导致 Aβ 沉积病理过程的关键〔4〕。APP 通过泛素化、糖基化、磷酸化、棕榈酰化和小泛素相关修饰物（SUMO）化等形式进行翻译后修饰。APP的翻译后修饰可调控 APP 的剪切、降解等代谢过程. 由此说明，阿尔茨海默病的发病极其复杂，目前单一学说都难己解释，特别随着 AD 领域基于 Aβ 研发新药临床试验的相继失败，经典的 Aβ 学说受到质疑。

本次实验结果表明，治1组是用首乌复方制剂，（BACE1） 活力， 治疗1组明显高于其他组，首乌本是传统中药，有抗衰老，延年益寿功能，应是抑制（BACE1） 活力才对，但相反了;而铝染毒组，（BACE1） 活力，与正常组很接近，或者说明，铝与Aβ沉积无关？而另一指标，乙酰胆碱酯酶（AchE）活力，明显降低了，与胆碱能神经递质有关？

3.2造模前、治疗后血红蛋白（Hb）比较，组间、前后均无明显差异。表明对造血系统无明显影响。虽血清谷-丙转氨酶各组间无明显差异，而血清总蛋白、胆固醇含量模型组均低于其他三组，反影肝功能模型组较其他三组差？都有可能！治1组血清尿素氮明显高于其他3组，反影肾功能受捐.

参考文献

[1]杜娟 黄昶荃 何馥倩。β 淀粉样蛋白清除的研究进展。中国老年学杂志 2021 ， 41 （2）：410-413

[2]肖飞，李晓光，张晓裕， 等。.D-半乳糖和铝联合应用诱导大脑产生阿尔茨海默病样损伤（英文）[J].Neuroscience Bulletin，2011，27（03）：143-155.

[3].崔雨婷，王亚琦，王培昌。阿尔茨海默病中β淀粉样蛋白的生成及清除的调节，《中国生物化学与分子生物学报》网络论文， 2020.11.1384，1-7

[4] 陈霞，巴智胜，龚其海，等。淀粉样前体蛋白翻译后修饰对老年痴呆病理影响的研究进展。中国新药与临床杂志（网络首发论文），2020-12-28

[5]叶应妩，王毓三主编.全国临床检验操作规程[M].南京： 东南大学出版社，1997（第2版） ：2页

[6]张树球，黄秋艳，李朝敢，刘燕，梁月秀，梁伟江，周国荃.用Y型水迷宫测定锌与海尔福口服液对铅染毒所致小鼠记忆障碍的改善作用[J].中国冶金工业医学杂志，2006（05）：546-548.