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摘要 目的：探讨Toll样受体4（TLR4）拮抗剂TAK-242对脑出血（ICH）小鼠神经功能的保护作用及机制。方法：将40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为Sham组、Sham+TAK-242组、ICH组和ICH+TAK-242组，10只/组；采用自体血注入法构建ICH模型；Sham+TAK-242组和ICH+TAK242组于造模后经腹腔注射3mg/kg TAK242，Sham组和ICH组经腹腔注射等体积溶剂。造模48 h后，采用Garcia评分系统进行神经功能评分；干湿重法测量脑组织含水量（BWC）；TUENL染色法检测血肿周围脑组织神经元凋亡；ELISA法检测血肿周围脑组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-10）、白介素1β（IL-1β）含量；Western blot检测脑组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3剪切体（cleaved caspase-3）、TLR4、髓样分化蛋白88（Myd88）和核因子ĸB（NF-ĸB）表达水平。结果：与ICH组比较，ICH+TAK242组小鼠BWC降低（P<0.05），神经功能评分增加（P<0.05）；脑组织凋亡神经元减少（P<0.05），凋亡标志物cleaved caspase3表达下调（P<0.05）；脑组织TNF-α、IL-6和IL-1β水平降低（P<0.05）；脑组织cleaved caspase-3、MyD88和NF-κB（p65）蛋白表达下调（P<0.05）。结论：TLR4拮抗剂TAK-242通过抑制TLR4/Myd88/NF-κB信号通路激活，减轻ICH小鼠血肿周围脑组织炎症损伤和神经元凋亡发挥神经保护作用。

关键词 脑出血；炎症；神经功能；Toll样受体4；TAK-242；核因子ĸB

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一种常见且严重的脑血管疾病，约占脑卒中的10%～15%，致死致残率较高[1]。据统计，约70%～80%存活的ICH患者遗留有不同程度的神经功能缺损[2]。大量研究显示，ICH后的继发性损伤是引起患者出现神经功能缺损的关键因素[3]。研究表明，Toll样受体4（toll like receptor 4，TLR）在ICH后通过识别损伤相关分子模式在中枢神经系统被激活，参与ICH病程中继发性神经损伤引起脑血管痉挛和神经元凋亡[4]。此外，有研究发现敲除TLR4基因的ICH模型小鼠脑损伤明显减轻[5]。以上研究提示抑制TLR4及下游信号事件可能成为治疗ICH的有效策略。因此，本研究旨在探讨外源性TLR4拮抗剂TAK-242是否有助于改善ICH后神经功能损害，以期为ICH的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1实验动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠40只，10～12周龄，体质量（23±4）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2016-0011。

1.2 主要试剂与仪器

TLR4拮抗剂TAK-242（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度≥98%），兔抗小鼠β-actin、Histone H3、cleaved caspase-3、MyD88和NF-κB（p65）一抗购自美国CST公司，兔抗小鼠TLR4抗体（Santa Cruz公司），TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA检测试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；NE-PER™核蛋白和胞浆蛋白抽提试剂盒（Thermo公司）。68507型小鼠脑立体定位仪（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；酶标免疫分析仪（Biotek MK3）。

1.3 动物模型制备与分组

实验前将40只小鼠置于饲养设施中，于21℃、相对湿度（50±10）%，并保持12：12 h的光-暗周期条件下适应性喂养1周。将小鼠随机分为Sham组、Sham+TAK-242组、ICH组和ICH+TAK-242组，每组10只。小鼠ICH模型建立方式参考文献[6]：手术当日使用60 mg/kg戊巴比妥深度麻醉小鼠后固定于脑立体定位仪上，术区剃毛消毒后，切开皮肤，暴露前囟，将微量注射泵定位于前囟0.8mm，旁开2mm，深3.5mm位置，使用颅骨钻垂直打孔，操作过程中应避免损伤脑组织，应用微量注射泵经钻孔将20µl小鼠自体血以2µl/min速率匀速注射到小鼠脑纹状体中，留针10min后缓慢拔针，骨蜡封闭颅骨创口，缝合皮肤。Sham组采用同样的手术方式，但术中不注入自体血。ICH模型建立后，Sham+TAK-242组和ICH+TAK242组小鼠经腹腔注射3mg/kg TAK242[7]，Sham组和ICH组小鼠经腹腔注射等体积溶剂。

1.4 神经功能评分

ICH造模48 h后，采用Garcia评分系统进行神经功能评分。该评分系统由自发性活动（0～3分）、四肢运动对称（0～3分）、前脚伸展（0～3分）、攀登（1～3分）、对双侧躯干的触碰反应（1～3分）以及对触须反应（1～3分）共6个方面组成，总分3～18分，得分越高表示神经功能越好[8]。

1.5 小鼠脑组织含水量测定

小鼠完成神经功能评价后，在深度麻醉下处死大鼠，去掉颅骨后迅速取脑。解剖并分离血肿周围基底节区、大脑皮层和小脑组织。取部分脑组织，使用滤纸吸干表面水分，分析天平称量其湿质量（W）后，置烤箱中于100 ℃条件下烘烤48 h至恒重，称量并记录干质量（D），计算小鼠脑组织含水量（BWC）=（W-D）/D×100%。

1.6 TUNEL染色

取部分小鼠脑组织，用生理盐水充分冲洗并吸取表面水分，置于4%多聚甲醛溶液中固定；进行常规脱水、透明、包埋及6 μm切片后，按照TUNEL凋亡检测试剂盒说明书步骤进行TUNEL染色，最后加抗荧光淬灭封片剂封片，于荧光显微镜200倍放大倍数下，计数Tunel阳性细胞数，以神经元出现绿色荧光为TUNEL阳性细胞，每张切片随机取6个视野进行评估。

1.7 脑组织炎症细胞因子检测

取部分血肿周围脑组织制备组织匀浆，4 ℃、12000g离心5 min后取上清液，使用ELISA法检测血清样本中TNF-α、IL-6、IL-1β含量水平，均严格按照相应试剂盒说明操作，最后使用酶标仪测定450 nm处吸光度值，并根据绘制的标准曲线计算各样品中待测指标含量水平。

1.8 Western blot检测小鼠脑组织蛋白表达

取部分血肿周围脑组织使用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤2次后吸干，按照NE-PER™核蛋白和胞浆蛋白抽提试剂盒说明书步骤提取蛋白。BCA法定量提取的脑组织蛋白后，取40μg样品蛋白经SDS-PAGE电泳转印至PVDF膜，然后以5%脱脂牛奶室温封闭2h后，以β-actin或Histone H3为内参，加入cleaved caspase-3、TLR4、MyD88和NF-κB（p65）一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次；最后加入二抗室温下孵育2h，ECL法显色，采用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.9 统计学方法

使用SPSS 20.0统计分析数据，以（x±s）表示计量资料，多组间比较使用单因素方差分析，两两比较采取SNK法；计数资料以n表示，采取卡方检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1小鼠ICH模型制备成功率

造模后，ICH小鼠自发运动减少，肢体无力，同侧肢体瘫痪，前肢不能同时触碰桌面，但能自主进食。ICH造模成功率为75.00（15/20），其中ICH组术后48h内死亡3只，ICH+TAK-242组术后48h内死亡2只，两组小鼠死亡率比较无统计学差异（2=0.267，P＞0.05）。

2.2TLR4拮抗剂对ICH小鼠脑水肿和神经功能的影响

与Sham组比较，ICH组小鼠血肿周围BWC显著增加，神经功能评显著减少（P<0.05）；与ICH组比较，ICH+TAK-242组BWC显著降低（P<0.05），神经功能评显著增加（P<0.05）。见表1。

2.3 TLR4拮抗剂对ICH小鼠血肿周围脑组织神经元凋亡的影响

与Sham组比较，ICH组小鼠血肿周围脑组织中凋亡神经元显著增多（P<0.05），凋亡标志物cleaved caspase-3蛋白表达显著上调（P<0.05）；与ICH组比较，ICH+TAK-242组小鼠血肿周围脑组织中凋亡神经元显著减少（P<0.05），cleaved caspase-3蛋白表达显著下调（P<0.05）。见图1。

2.4 TLR4拮抗剂对ICH小鼠血肿周围脑组织炎症细胞因子表达的影响

与Sham组比较，ICH组小鼠血肿周围脑组织TNF-α、IL-6和IL-1β水平均显著增加（P<0.05）；与ICH组比较，ICH+TAK-242组小鼠血肿周围脑组织TNF-α、IL-6和IL-1β水平均显著降低（P<0.05）。见表2。

2.5 TLR4拮抗剂对ICH小鼠血肿周围脑组织TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达的影响

与Sham组比较，ICH组小鼠血肿周围脑组织TLR4、MyD88和NF-κB（p65）蛋白表达显著上调（P<0.05）；与ICH组比较，ICH+TAK-242组小鼠血肿周围脑组织中MyD88和NF-κB（p65）蛋白表达显著下调（P<0.05），TLR4蛋白表达无显著改变（P>0.05）。见图2。

3 讨论

TLR4介导的炎症反应已被证实与阿尔兹海默病、帕金森病等多种中枢神经系统疾病密切相关[9]。在ICH所致继发性损伤的相关研究中发现，血肿中血红素通过和TLR4结合，激活下游信号事件发挥炎症损伤作用。因此通过调控TLR4信号通路，减轻其活化所致的炎症损伤和神经功能缺损或是ICH治疗的有效策略。本研究中采用自体血注入法构建小鼠ICH模型，造模后可以观察到小鼠ICH后的典型表现如自发运动减少，肢体无力，同侧肢体瘫痪等神经功能损伤症状。另外ICH模型组小鼠BWC较Sham组明显增加、神经功能评分显著降低，结合上述几点可见本例中小鼠ICH模型构建成功。TAK-242是一种外源性TLR4拮抗剂，可以选择性结合TLR4并抑制其下游信号事件。TAK242可作用于TLR4胞内段的Cys747位点，从关键环节阻断TLR4信号向下游的传递。此外，TAK242分子量小、亲脂性强，易于透过细胞膜和血脑屏障等生物屏障，其已被证实对脂多糖诱导的脓毒症心肌损伤具有明显的保护效果[10]。本研究结果显示，使用3 mg/kg TAK242治疗ICH小鼠有效减少了炎性细胞因子、WBC和神经功能损伤，对ICH模型小鼠显示出良好的治疗潜力。

神经炎症在血肿形成后即开始形成并扩大，是ICH后继发性脑损伤的重要宿主防御反应。小胶质细胞、巨噬细胞和血肿周围白细胞活化是神经炎症形成及扩大的始动因素和关键机制。活化的小胶质细胞/巨噬细胞和外周血白细胞释放促炎性细胞因子包TNF-α、IL-6及L-1β，最终导致脑水肿、血脑屏障破坏和神经元凋亡。ICH诱导的神经元凋亡导致中性粒细胞和白细胞浸润到脑内，进一步加重炎症损伤。本研究中，TUNEL染色提示TAK242治疗明显抑制了血肿周围脑组织神经元凋亡，发挥神经保护作用；与此相一致的是，Western blot实验中，ICH小鼠伴有明显的caspase-3剪切体水平表达上调，而TAK242治疗后该指标明显改善。以上这些结果提示TAK242对ICH神经损伤的保护作用可能与抑制炎症反应及神经元凋亡有关。

TLRs属于模式识别受体家族，在先天免疫和炎症反应中发挥关键作用。在TLR家族成员中，TLR4的功能作用至关重要。在ICH病程中，TLR4被血红素、纤维蛋白原、热休克蛋白等多种内源性配体激活。TLR4信号向胞内传递过程中，首先与接头蛋白MyD88相互作用，并启动转录因子的激活，调控促炎细胞因子基因的表达[11]。以往众多研究已证实TAK242在体内和体外对其他系统疾病具有抗炎作用。在这些研究中，TLR4及其下游转录因子NF-κB是研究热点。因此，在本研究中检测了TLR4介导的MyD88/NF-κB通路，结果显示TLR4、MyD88和NF-κB在ICH后明显升高，而TAK242可以通过与TLR4特异性结合而下调MyD88和NF-κB表达，从而抑制该信号通路的激活，减少炎症细胞因子的形成。以上研究结果表明TLR4/MyD88/NF-κB信号通路参与了TAK242对ICH继发性炎症损伤的保护作用。

综上所述，TLR4拮抗剂TAK242通过抑制TLR4/Myd88/NF-κB信号通路激活，减轻ICH小鼠血肿周围脑组织炎症损伤和神经元凋亡发挥神经保护作用。

参考文献

[1]杨生琴. 立体定向软通道颅内血肿清除术治疗高血压性脑出血患者近期神经功能恢复临床研究[J]. 陕西医学杂志， 2019， 48（4）：482-484.

[2]李学迁. 微创置管抽吸术对老年脑出血患者神经功能缺损及炎症因子的影响[J]. 航空航天医学杂志， 2020， 31（8）：960-961.

[3]Chen S， Peng J， Sherchan P， et al. TREM2 activation attenuates neuroinflammation and neuronal apoptosis via PI3K/Akt pathway after intracerebral hemorrhage in mice[J]. J Neuroinflammation， 2020， 17（1）：168.

[4]Zhang D， Shen X， Pang K， et al. VSIG4 alleviates intracerebral hemorrhage induced brain injury by suppressing TLR4-regulated inflammatory response[J]. Brain Res Bull， 2021， 176：67-75.

[5]Lin S， Yin Q， Zhong Q， et al. Heme activates TLR4-mediated inflammatory injury via MyD88/TRIF signaling pathway in intracerebral hemorrhage[J]. J Neuroinflammation， 2012， 9：46.

[6]Chang CF， Chen SF， Lee TS， et al. Caveolin-1 deletion reduces early brain injury after experimental intracerebral hemorrhage[J]. Am J Pathol， 2011， 178（4）：1749-1761.

[7]Okada T， Lei L， Nishikawa H， et al. TAK-242， toll-like receptor 4 antagonist， attenuates brain edema in subarachnoid hemorrhage mice[J]. Acta Neurochir Suppl， 2020， 127：77-81.

[8]Garcia JH， Wagner S， Liu KF， et al. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Statistical validation[J]. Stroke， 1995， 26（4）：627-634.

[9]陶一鸣， 杜艳军， 王静芝，等. TLR4/NF-κB信号通路在阿尔茨海默病炎性反应中的表达及电针干预影响[J]. 中华中医药学刊， 2021， 39（1）：168-171.

[10]刘紫阳， 杨凯， 邓婷， 等. TAK242阻断TLR4通路起到对脓毒性心肌损伤和心功能障碍的保护作用[J]. 中华危重病急救医学， 2021， 33（10）：1226-1231.

[11]Zhou K， Cui S， Duan W， et al. Cold-inducible RNA-binding protein contributes to intracerebral hemorrhage-induced brain injury via TLR4 signaling[J]. Brain Behav， 2020， 10（6）：e01618.