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2.作者简介：常靓（1987.07 - ），女，汉族，籍贯：江苏省靖江市，毕业院校：中国药科大学，现供职单位：上海上药信谊药厂有限公司，工程师，学位：硕士研究生，研究方向：从事药品制剂研发，

【摘要】建立硝苯地平原料药粒径分布检测方法，采用激光散射法测定原料药的粒径分布，并进行了方法学考察；比较不同粒径硝苯地平原料药制备的硝苯地平缓释片的体外溶出曲线，以Bayer公司的硝苯地平缓释片（Adalat®-L20）为参比制剂，采用f2相似因子法，对溶出条件进行筛选。结果表明，建立的原料药粒径分布检测方法简便、准确，优化后的体外溶出曲线测定方法具有区分力，可用于指导硝苯地平缓释片一致性评价的处方工艺开发和优化。

【关键词】硝苯地平；粒径分布；溶出曲线；一致性评价

【中图分类号】R9  【文献标志码】A  【文章编码】

1.引言

硝苯地平属于二氢吡啶类钙离子通道拮抗剂，主要用于治疗原发性高血压 、肾性高血压和心绞痛。相较于普通制剂，硝苯地平缓释片可持久维持血药浓度，延长药效作用时间，减少不良反应。硝苯地平缓释片的参比制剂为Bayer公司的Adalat®-L 20[1]，参比制剂处方中无缓释基质。

硝苯地平属于BCS II类药物，在水中几乎不溶，体内吸收与体外溶出行为密切相关。硝苯地平的粒径分布会直接影响相应制剂的体外溶出行为，进而影响生物利用度。因此，在硝苯地平缓释片的研究过程中，为了更好地预测体内生物等效性，需开发出具有区分力的体外溶出方法，严格控制硝苯地平原料药的粒径分布。

目前，粒度和粒度分布最常用的测定方法包括显微镜法、扫描电子显微镜、筛分法和光散射法[2]。其中激光散射法是近几年广泛应用的粒度测定方法，具有分析速度快、精度高、人为因素造成误差小等优点，越来越多地应用于原料药和制剂的粒度控制中[3]。

本研究建立了硝苯地平原料药粒径分布的测定方法，优化了硝苯地平缓释片的溶出曲线测定方法，筛选出了具有区分力的体外溶出方法，通过考察不同粒径原料药制备的硝苯地平缓释片的体外溶出曲线，并与参比制剂进行相似性比较，制定了硝苯地平缓释片中原料药的粒径控制范围。

2材料和方法

2.1试药

硝苯地平（常州四药制药有限公司，批号1803267，含量99.6%），硝苯地平对照品（中国食品药品检定研究院，批号100338-201806，含量99.9%），硝苯地平缓释片Adalat®-L20（バイェル薬品株式会社，规格20mg，批号JPS0089）

2.2试剂

甲醇（色谱纯，Merk），冰醋酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），醋酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），吐温80（分析纯，TCI）

2.3 仪器

Malvern Mastersizer 3000激光粒度分析仪、Hydro MV进样器（英国Malvern仪器有限公司）、KQ-100DV型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）、SOTAX AT7 smart溶出仪（瑞士SOTAX公司）、Agilent 1200型高效液相色谱仪（安捷伦科技（中国）有限公司）

2.4 方法

2.4.1 原料药粒径分布检测方法的建立

1）测定方法的选择

根据硝苯地平的性质选择干法测定或湿法测定，本研究首先尝试采用了干法（Mastersizer Aero S）来测定硝苯地平原料药的粒径，由于硝苯地平略有引湿性，干法测定时，样品的流动性较差，不能流畅地输送至样品池，干法测量数据波动性较大，不能满足粒度分布的测定要求。而硝苯地平原料药在水中几乎不溶，故选择了湿法进行测定。

2）样品的制备

文献[4，5]中大多采用在分散介质水中加入一定浓度的表面活性剂吐温80来降低表面张力，促进样品分散均匀，但表面活性剂的加入会造成部分颗粒的溶解，尤其是细粒子的溶解，影响测量结果，因此在本研究中仅以水作为分散介质，采用超声的方式使样品分散均匀，具体操作如下：称取硝苯地平原料药0.10g于烧杯中，加入纯化水30ml，超声使分散均匀。

3）仪器参数设置

仪器参数设定为：折射率1.520，吸光值0.1，遮光度范围5%～15%，样品池泵速2000rpm，测量背景时间15s，测量时间15s，数据采集测量3次取平均值。

4）样品处理超声时间的选择

参照“2.4.1”项下样品制备方法和参数设置，分别考察超声2min、5min和8min对粒径测量结果的影响。

5） 遮光度的选择

参照2.4.1”项下样品制备方法和参数设置，分别考察遮光度为5%、10%和15%对粒径测量结果的影响。

6） 泵速的选择

参照2.4.1”项下样品制备方法和参数设置，分别考察泵速为1500rpm，2000rpm和2500rpm对粒径测量结果的影响。

7） 重复性试验

分析人员1按照“2.4.1”项下方法配制6份样品，进行测定，计算相对标准偏差（RSD）。

8） 中间精密度试验

由不同分析人员不同时间按照“2.4.1”项下方法配制6份样品，进行测定，，并与分析人员1进行比较，计算12份样品的RSD值。

2.4.2 原料药粒径分布的测定

取不同粒径分布的硝苯地平原料药，按照“2.4.1”项下方法和参数分别进行测定，并将这三批不同粒径分布的原料药采用相同的处方工艺分别制备成硝苯地平缓释片。

2.4.3 体外溶出曲线方法的建立

1）色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（RP18， 15cm×4.6mm， 5μm），以甲醇：水（3：2，v/v）为流动相，检测波长为235nm，柱温为25℃，流速为1.0ml/min，进样量为50μl。

2） pH-溶解度曲线

取过量的硝苯地平原料药置具塞摇瓶中，分别加入pH1.2、pH2.0、pH4.0、pH4.5、pH5.5、pH6.8、pH7.4和pH8.0盐酸溶液和缓冲溶液各10ml，平行配制两份，置37℃水浴中振荡24h，使之形成饱和溶液，滤过，取续滤液进样进行测定。

3） 参照日本橙皮书中方法测定体外溶出曲线

日本橙皮书中收录了硝苯地平缓释片的体外溶出试验信息[6]，分别以含有0.3%吐温80的pH1.2盐酸溶液、pH4.0醋酸盐缓冲液、水和pH6.8磷酸盐缓冲液为溶出介质，采用桨法，转速为75转/分钟。由于硝苯地平为非pH依赖型药物，在各介质中的溶出曲线差异不大，因此，参考日本橙皮书中方法，仅先考察不同原料粒径的硝苯地平缓释片在含有0.3%吐温80的pH4.0醋酸盐缓冲液中的体外溶出曲线。

4） 增溶剂用量的考察

考察了增溶剂吐温80的不同用量（0.3%、0.15%和0.05%）对不同原料药粒径的硝苯地平缓释片体外溶出曲线的影响，仍采用桨法，转速为75转/分钟。

5） 转速的考察

考察了在含有0.05%吐温80的pH4.0醋酸盐缓冲液溶出介质中，不同转速（100转/分钟、75转/分钟和50转/分钟）对不同原料药粒径的硝苯地平缓释片体外溶出曲线的影响。

6）溶出曲线测定方法的确定

取硝苯地平缓释片，采用桨法，以含有0.05%吐温80的pH4.0醋酸盐缓冲液900ml为溶出介质，转速为50转/分钟，依法操作，经0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12和24小时时，分别取溶液10ml，滤过，并即时补充同温度同体积的溶出介质，取续滤液作为供试品溶液。另取硝苯地平对照品适量，加甲醇溶解，并用溶出介质定量稀释成每1ml约含硝苯地平11.2μg的溶液，作为对照品溶液，照“2.4.3”项下色谱条件，注入液相色谱仪，按外标法计算出每片的溶出量。

2.4.4 体外溶出曲线的测定

取参比制剂和不同原料粒径的硝苯地平缓释片（样品A、样品B和样品C），采用确定的溶出曲线测定方法，测定各制剂的溶出曲线，并对比曲线差异。

2.4.5 原料药粒径范围的确定

采用确定的溶出曲线测定方法，考察了不同粒径原料药制备的硝苯地平缓释片的体外溶出曲线，并与参比制剂进行溶出曲线相似性比较（根据f2值进行判断），从而确定可接受的原料药粒径范围。

3 结果

3.1 原料药粒径分布检测方法的建立

1）样品处理超声时间

考察了样品处理超声时间对粒径测量结果的影响，结果显示，当超声时间过短时，样品未能完全分散，存在团聚现象，测量结果重现性较差；而当超声时间过长，容易破坏原料本身粒径大小，因此确定超声时间为5min。

2） 遮光度

考察了遮光度对粒径测量结果的影响，结果显示，当遮光度在5%～15%范围内，对测量结果的影响较小，重现性较好。

3）泵速

考察了泵速对粒径测量结果的影响，结果显示，当泵速在1500rpm～2500rpm范围内，测量结果无显著差异，但泵速低可能会导致大的颗粒无法均匀分散，泵速过高可能会产生气泡，影响测量结果，因此最终泵速设定为2000rpm。

4） 重复性试验

6份样品D（10）的RSD为7.1%，D（50）的RSD为3.9%，D（90）的RSD为5.0%，表明本方法重复性良好。

5） 中间精密度试验

12份样品D（10）的RSD为7.2%，D（50）的RSD为3.7%，D（90）的RSD为5.0%，表明本方法中间精密度良好。

3.2 原料药粒径分布的测定

硝苯地平原料药粒径分布测定结果及对应的制剂批号见表1。

3.3 体外溶出曲线方法的建立

1） pH-溶解度曲线

考察类硝苯地平原料药在不同pH介质中的溶解度，结果显示，硝苯地平为非pH依赖型药物，在各介质中的饱和溶解度变化不大。

2）日本橙皮书中方法体外溶出曲线测定

不同原料粒径的硝苯地平缓释片在含有0.3%吐温80的pH4.0醋酸盐缓冲液中的体外溶出曲线结果见图1。

根据参比制剂说明书中的处方组成以及水中崩散现象，推测硝苯地平缓释片主要通过控制原料药的粒径来达到缓释效果。而参照日本橙皮书中方法对不同原料药粒径的硝苯地平缓释片（细粒径样品A、中等粒径样品B和粗粒径样品C）进行溶出曲线考察，样品A、样品B和样品C与参比制剂相比，体外溶出曲线均相似（f2因子分别为51.7、73.0和74.9，均大于50），尤其对于样品B和样品C，无法看出显著差异，不能很好地指导处方工艺开发，因此需对体外溶出方法进行优化。

3） 增溶剂用量

考察了增溶剂用量对不同原料药粒径的硝苯地平缓释片体外溶出曲线的影响，结果显示，随着增溶剂用量的减少，样品12h的累积释放量降低，但是区分力增强。当增溶剂用量分别为0.3%和0.15%时，样品B和样品C的体外溶出曲线与参比制剂相比，差异较小，无法看出两制剂之间的差异，而当增溶剂量为0.05%时，样品C与参比制剂的差异增大，样品C的体外溶出明显较样品B慢，与原料药的粒径趋势吻合，因此，增溶剂的用量拟选用0.05%。

4） 转速

考察了在含有0.05%吐温80的pH4.0醋酸盐缓冲液溶出介质中，不同转速对不同原料药粒径的硝苯地平缓释片体外溶出曲线的影响，结果显示，随着搅拌桨转速的降低，样品24h的累积释放量无显著变化，但可以看出，随着搅拌桨转速的降低，区分力增强，因此，搅拌桨的转速拟采用每分钟50转。

3.4 体外溶出曲线的测定

参比制剂和不同原料粒径的硝苯地平缓释片（样品A、样品B和样品C），的溶出曲线结果见图2。结果显示，以含有0.05%吐温80的pH4.0醋酸盐缓冲液作为溶出介质，采用桨法50转/分钟，能够很好地区分不同粒径原料药制备的硝苯地平缓释片的体外溶出行为的差异。随着原料粒径的减小，释放速率加快，24小时累积释放量增加。通过与参比制剂的体外溶出结果进行比较，仅样品B的体外溶出曲线与参比制剂一致（f2>50）。

3.5 原料药粒径范围的确定

通过考察不同粒径原料药制备的硝苯地平缓释片的体外溶出曲线，并与参比制剂进行溶出曲线相似性比较，确定了可接受的原料药粒径范围。结果显示，当原料粒径满足：15μm≤D（50）≤25μm，30μm≤D（90）≤45μm时，自制制剂与参比制剂体外溶出行为一致。

4 讨论

目前文献报道的硝苯地平原料药粒径测定方法大多采用在分散介质中加入一定浓度的表面活性剂，但表面活性剂的加入可能会造成部分颗粒的溶解，影响测量结果。本研究建立了硝苯地平原料药的粒径检测方法，未使用表面活性剂，操作简单，测定结果准确，为硝苯地平缓释片中关键质量属性原料药粒径的控制提供了实验依据。

本研究提供了一种体外溶出方法筛选的思路，根据不同粒径原料药对体外溶出的影响，筛选出了具有区分力的溶出曲线测定方法，并制定了硝苯地平缓释片中原料药粒径的控制范围。虽然在含有0.05%吐温80的pH4.0醋酸盐缓冲液中未达到漏槽条件，但是能很好地体现出不同粒径原料药制备的硝苯地平缓释片体外溶出行为的差异，有效地指导产品的处方工艺开发和优化。

仿制药一致性评价要求仿制制剂在质量和疗效上需与参比制剂一致，即需与参比制剂达到体外和体内一致性。对于BCS分类II类药物（低溶解性和高渗透性），体内吸收主要与产品的体外释放有关，因此，建立一种具有区分力的体外溶出曲线测定方法，能够有效地指导处方工艺开发，加大产品体内生物等效性试验成功的几率，对一致性评价具有重要的指导意义。

【参考文献】

【1】 NMPA（国内指导原则）：《总局关于发布仿制药参比制剂目录（第七批）的通告（2017年第115号）》，[EB/OL]. [2017-07-21]. （https：//www.nmpa.gov.cn）

【2】 郝福， 胡向青， 巴晓雨， 等. 激光粒度分析技术在药物研究和质量控制中的应用进展[J]. 分析测试技术与仪器. 2017， 23（2）： 72-80.

【3】 彭飚， 常甜甜. 几种主要粒度分析方法的优缺点[J]. 科技与创新. 2019， 10： 35-39.

【4】 刘洁， 方晶， 廟宇阳. 硝苯地平不同粒度对其缓释片剂质量的影响[J]. 中国药师. 2018， 21（6）： 1108-1111.

【5】 刘晓莉， 马飞. 硝苯地平原料药的粒度及粒度分布研究[J]. 广州化工. 2016， 44（7）：99-101.

【6】 The Orange Book（日本橙皮书）. ニフェジピン徐放錠 （硝苯地平缓释片）[EB/OL]. [2016-09-01]. （http：//www.jp-orangebook.gr.jp）