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【摘要】目的 探讨沙眼衣原体（CT）及不同基因型别的感染率和其对精子常规参数，DNA碎片指数（DFI）和精子活性氧（ROS）的影响。方法 收集男性不育患者和同期健康男性精液标本，采用巢氏PCR检测CT的Ompl基因型VS1-VS2 序列，并测序分型，按照世界卫生组织推荐的方法进行精液相关参数指标的检测，采用精子染色质扩散实验检测精子核DNA完整性和运用化学发光法检测精子ROS水平。结果 男性不育患者CT 阳性检出率为10.7%（42/394）明显高于健康男性的6.3%（21/335），P<0.05;CT阳性的男性不育人群DFI和ROS均明显高于CT阴性的男性不育人群， CT阳性的健康男性DFI和ROS均明显高于CT阴性的健康男性，均P<0.05;不同CT基因型在男性不育患者和健康男性中的分布无明显统计学差异性，P>0.05;各CT基因型阳性的男性不育人群之间分别在精液液化时间、PH值、精液体积、精液浓度、PR前向运动精子、（PR+NR）精子活力、精子正常形态率、DFI和ROS等指标上均没有统计学意义，均P>0.05。 结论 男性生殖道CT的感染可能因为精液中ROS增加和精子DNA损伤的加重而与男性不育有关，但可能与基因型别的不同无关。

【关键词】男性不育;沙眼衣原体;基因型;活性氧

由于环境、社会和心理等因素的影响，目前世界上约有15%～20%的育龄夫妇存在生育障碍，男性精子的数量和质量也明显呈现下降的趋势[1]，男性不育所占比例也由30%上升到接近50%，男性生殖健康正严重受到威胁。沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，CT）是一种性传播疾病病原体，可造成生殖道感染。在美国、英国及欧盟等国家CT的报病比例占所有性病传播疾病的80%以上[2]，而在我国CT的报病比例也呈现逐年增高，其人群感染的阳性率已介于5%～25[2-4]。男性生殖系统感染CT会引起前列腺炎、附睾炎、尿道炎等一系列容易导致男性不育的疾病，会降低精子质量，影响精子的游走和定植能力，增加了男性不育的概率[5]，但也有研究显示CT对男性不育并无显著的影响[5]。因此，CT的感染对于男性不育及精液的直接影响目前仍有争议，尚无统一结论。CT按照基因型不同，依据其主要外膜蛋白（major outer membrane protein，MOMP）抗原决定簇差异可分为 19 个血清型，不同基因型 CT感染引起的疾病可有不同，其中D～K 型主要引起泌尿生殖道感染[6]。目前，关于CT不同基因型别致病性的研究也主要是集中于女性生殖道感染与不育的影响，而其对于男性精子以及不育的影响的研究鲜有文献报道。 本研究拟通过调查研究本院在男性不育中CT及不同基因型别感染率和对精子常规参数，精子核DNA损伤和精子活性氧（reactive oxygen species， ROS）的影响，为探明不同基因型别CT与男性不育的相关性及致病机制，进一步完善CT致病性的相关理论，对CT感染的治疗及预防提供科学的依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2018年9月到2021年6月于我院生殖中心就诊和体检并经诊断为男性不育的患者和同期健康男性，经我院医学伦理委员会批准，入选的所有男性不育患者均签署知情同意书。男性不育的纳入标准为：婚后同居1年或以上、性生活正常、非女方不孕因素而不育者。健康男性纳入标准为：与妻子有非人工方式的怀孕史且无临床症状，精液常规分析正常者。最终有394例男性不育患者纳入研究，年龄为年龄介于22～46 （ 34.6±7.1）岁，同期纳入近两年内生育过子女的健康男性335例，年龄介于23～45 （ 32.6±7.5）岁。在年龄上，两组之间差异无统计学意义（t=1.252， P>0.05）。

1.2 标本的采集与处理 禁欲3～5天后，收集前要求所有受试者用肥皂和清水洗净双手并用手淫法采取精液，将留取精液标本置于一干净的、广口玻璃容器中，置于37°C水浴箱中液化。

1.3巢氏 PCR 检测 CT 的 Ompl 基因型 取液化好的精液，在无菌的条件下2500r/min离心10min后，取上清采用QIAamp DNA Mini Kit 试剂盒提取CT核酸，然后按参考文献的操作步骤采用巢式PCR 扩增外膜蛋白 Omp1 基因的 VS1-VS2 序列，并测序分型。

1.4 精液参数的分析 严格按照世界卫生组织《人类精液检查与处理实验室手册》推荐的方法[6]进行检测。检测的主要参数包括液化时间、PH值、精液体积、精液浓度、PR前向运动精子百分率、（PR+NR）精子活力百分率和精子正常形态百分率等指标， 精液分析所用仪器为以色列SQA_V精液全自动分析仪。检测人群为CT阳性的男性不育者和CT阳性的健康男性，以及采用计算机生成随机数的形式从前200例中分别随机抽取的30例CT阴性的男性不育者和CT阴性的健康男性。

1.5 精子核DNA损伤分析 采用精子染色质扩散实验（Sperm Chromatin Dispersion， SCD）进行精子核DNA完整性检测，结果以 DNA 碎片指数（DFI）表示，试剂盒由深圳华康生物医学工程有限公司提供，严格按照说明书进行操作。检测人群参照1.4。

1.6运用化学发光法检测精子ROS水平 产物使用luminol（5-amino-2，3-dihydro-1，4-phthalazinedione;Sigma Aldrich）作为探针进行检测。①精子细胞经PBS清洗后，调整终浓度为20×106/mL收集，少精患者（sperm concentration<20×106/mL），luminol信号按照精子比例放大到20×106/mL。②将溶解在DMSO中的luminol（10μL，5mmol/L）加入到400μL的精子悬液中，立刻记录数据。将5μL的luminol加入到400μL的PBS溶液中作为空白对照。25μL H2O2和10μL luminol混合悬液作为阳性对照。检测人群参照1.4。

1.7 统计学处理 采用 SPSS21. 0 软件进行统计和分析，计数资料以例数或百分率表示，采用χ2或Fisher检验分析，计量资料以均数±标准差（x±s ）表示，计量资料的比较根据方差是否齐性，分别采用T检验或Dunnett’s T3 检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2 结果

2.1男性不育患者和健康男性的 CT阳性检出率 男性不育患者CT 阳性检出率为10.7%（42/394）高于健康男性的6.3%（21/335），差异有统计学意义 （χ2=4.422，P= 0.035）。

2.2男性不育人群和健康男性精液参数、精子核DNA损伤和ROS的比较 各组之间在液化时间、PH值、精液体积、精液浓度和PR前向运动精子这5项指标间均无统计学差异性，均P>0.05;CT阳性和CT阴性的男性不育人群（PR+NR）精子活力和精子正常形态率均明显高于CT阴性的健康男性，均P<0.05;CT阳性和CT阴性的男性不育人群以及CT 阳性的健康男性DFI和ROS均明显高于CT阴性的健康男性，均P<0.05;CT阳性的男性不育人群DFI和ROS还均明显高于CT阴性的男性不育人群，均P<0.05;见表1。

2.3男性不育患者和健康男性的 CT不同基因型型别的比较 不同CT基因型在男性不育患者和健康男性中的分布情况，两组间差异无统计学意义（χ2=1.501，P=0.981）; 见表2。

2.4 不同CT基因型阳性男性不育人群精液参数、精子核DNA损伤和ROS的比较 各CT基因型阳性的男性不育人群之间分别在精液液化时间、PH值、精液体积、精液浓度、PR前向运动精子、（PR+NR）精子活力、精子正常形态率、DFI和ROS等指标上均没有统计学意义，均P>0.05;见表3。

3 讨论

男性不育与生殖器官先天异常、遗传性疾病、内分泌性不育、自身免疫性不育、感染、环境及理化等因素有关[4]。约有15%的男性不育是由生殖道感染引起的[3] ，而CT男性生殖道感染的主要病原体之一 。男性生殖道 CT感染后可能对患者的精液造成了严重的影响，如精液液化时间延长、精子浓度、活动率降低和畸形率升高等，增加了男性不育的概率。从本研究的流行病数据来看，男性不育患者CT 阳性检出率明显高于健康男性，进一步表明男性生殖道CT感染可能是导致男性不育的重要原因。

有研究表明，当机体内环境受到破坏发生氧化应激时会产生ROS，而ROS导致的精子功能障碍目前被认为是男性不育症的一个重要原因[4]。在生理情况下，ROS在精子的获能、顶体反应和受精等功能上扮演着多种角色[6]。但当ROS含量过高超过机体抗氧化体系的还原能力时，会导致氧化应激，可引起精子膜脂质过氧化损伤、精子DNA损伤、精子线粒体损伤及细胞凋亡，从而破坏精子功能和存活[7]。其中，外源性感染是导致ROS产生的重要原因[8]，包括大肠杆菌、淋球菌、支原体和衣原体等所致的泌尿生殖系统感染，可引起精液中的ROS增加，最终导致精子缺乏线粒体功能和DNA损伤，引起精子异常。据研究报道[9]，CT可依赖 NADPH氧化酶的活性促进ROS的产生，诱导精子过早死亡。这表明，生殖道CT感染可能会使ROS增加而影响精子的功能引起男性不育。从本研究的数据来看，CT阳性的男性不育人群DFI和ROS均明显高于CT阴性的男性不育人群，另外 CT阳性的健康男性DFI和ROS均明显高于CT阴性的健康男性，表明了男性生殖道CT感染可能与精液的ROS增加和精子DNA损伤的加重，从而引起精子异常，可能是导致男性不育的重要原因。

国内杨斌等[10]的研究显示，J 型CT 女性感染者宫颈分泌物中 cHSP60 水平显著高于其他各型，而且相应的J 型宫颈拭子中 白细胞的比例最高，表明J 型可能是女性生殖道感染中炎症损伤最为严重的基因型型别。国内杨艳华等[11]的研究表明不同 CT 基因型感染与输卵管性不孕可能有关，其中E，F 和 J 三种基因型别可能和 TFI 输卵管性不孕不孕更为密切。不同CT基因型别与男性不育的关系目前鲜有文献报道。从本研究的情况来看，不同CT基因型在男性不育人群和健康男性中的分布没有明显的统计学差异性，另外CT各基因型阳性男性不育人群在精液液化时间、PH值、精液体积、精液浓度、PR前向运动精子、（PR+NR）精子活力、精子正常形态率、DFI和ROS等指标间也均无统计学差异性，表明男性生殖道CT的感染可能因为精液中ROS增加和精子DNA损伤的加重而与男性不育有关，但可能与基因型别的不同无关。但是本研究中不育人群中CT阳性例数仅仅42例，各基因型别的例数就更少了，其中最多的J型也才9例，所以本研究的结论因为数据量的不足有明显的瑕疵，要探明男性不育与CT基因型别的关系，还需增加病例进一步深入研究。

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