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摘要：丛枝菌根（AM）真菌是一类重要的土壤有益微生物，能帮助植物获取养分，提高抗性，在绿色农业发展中存在巨大应用价值。然而，由于AM真菌必须与根系共生才能完成生命周期，因此菌剂的获取与扩繁成为真菌应用的重要制约因素之一。本文从AM真菌的分离、鉴定和扩繁3个方面介绍了相关研究领域的前沿动态，旨在推进对AM真菌培养技术的深入研究，并为科学研究和生产实践中AM真菌的培养提供技术参考。AM真菌的分离湿筛法较为普遍，鉴定主要采用生理或分子生物学方法，传统的扩繁方法以盆栽法和毛根无菌扩繁法为主，而最近新报道的液体培养法和非共生培养法则为AM真菌的扩繁提供了更多可能，为液体条件下的真菌应用和菌剂的批量生产提供了新思路和新方法。

关键词：AM真菌;培养;鉴定

中图分类号：N33      文献标识码：A

AM真菌是一类自然界中广泛存在的土壤有益微生物，能与80%以上的陆生植物形成共生关系[1]。其孢子在土壤中萌发形成根外菌丝，与植物根系接触并侵入内部形成根内菌丝。根内菌丝到达皮层后，萌发出泡囊和丛枝结构[2]。AM真菌发达的根外菌丝能够到达植物根系不能接触的领域，吸收营养物质转运给植物，并能分泌有机酸和磷酸酶等物质，活化土壤中的养分，提高植物的养分效率[3]。除此之外，AM真菌的共生还能刺激植物的光合作用，提高植物对于干旱、高盐、重金属等非生物胁迫的抗性[4]。

而截至目前，AM真菌尚无法通过纯培养的方式快速扩繁增殖。其须与植物根系形成共生关系后，才能完成生命周期[5]。总体来看，AM真菌的培养主要分为分离、鉴定和扩繁三大步骤。本文将依次对这三大步骤的操作方法进行归纳和对比，从而汇总AM真菌培养的相关技术。

1 AM真菌的采集和分离

AM真菌孢子可在根层土壤中采集，然后直接从中进行分离，也可将根层土壤种植韭葱、小米等易侵染植物，对其扩增富集后再分离。分离主要有湿筛倾析-蔗糖离心和湿筛倾析-直接分离两种方法。湿筛倾析-蔗糖离心分离是最常用的方法，参考Danielson和刘润进等描述略作修改[6，7]，主要包括以下步骤：

将0.8mm、0.25mm和0.055mm孔径的筛网自上而下叠放，土壤样品在烧杯中加水充分搅拌均匀后静置20-30s，把上清液倒入筛网中;在烧杯中加水重悬，重复数次，至上清较为清澈为止;逐层冲洗筛网，直至最后一层;将最后一层筛网上的筛出物冲洗到离心管中，3000r/min离心3min，除上清，用清水重悬，重复离心;加入50%的蔗糖溶液，充分混匀，2000r/min离心2-3min;将上清转移至0.055mm孔径的筛网上，用清水冲洗干净;最后转移至培养皿，在体视镜下观察，并将形态不同的孢子分类挑出。

对于只关注目标菌种的一些试验，可采用简化版的湿筛倾析-直接分离法，即用湿筛倾析初步去除杂质后，不经蔗糖离心，直接在体视镜下观察，挑取符合目标菌种特征的孢子进行下一步实验操作。该方法避免高浓度蔗糖对孢子的损伤，也可避免由于蔗糖冲洗不净而引起细菌真菌大量滋生。但该方法由于对杂质，尤其是细沙粒的去除程度不够，在分离孢子时会造成一定程度的干扰，导致部分孢子难以收集，因此不适合需要尽量完整收集土壤孢子的相关研究工作。

2 AM真菌的鉴定

为保证菌种的纯正，常先在育苗盘中进行单孢培养。按王幼珊等描述[8]，略有改动，具体操作如下：将育苗盘和基质灭菌备用;播入3颗经表面灭菌的玉米种子;将分离出的单孢子用吸管滴到种子附近;覆基质培养，出苗后剪去多余幼苗，每个育苗盘只留一棵;低磷培养一个月后，取部分根段测定侵染情况，侵染率高于50%时，可进行下一步扩繁培养。AM真菌孢子的单孢培养也可采用幼苗法，即用提前育好的宿主植物幼苗代替种子，移栽进经灭菌处理的育苗盘中，将单个孢子用吸管滴到幼苗的根上，盖基质进行后续培养。

单孢培养完成后，可筛取部分孢子进行菌种鉴定。AM真菌的鉴定主要分为生理鉴定和分子鉴定两种方法。

2.1 生理鉴定法

生理方法主要针对AM真菌孢子的颜色、大小、形状等分类鉴定[8]。具体步骤为：取孢子在体视镜下观察记录颜色、大小、形状等表观形态特征;后取干净载玻片，左测滴一滴聚乙烯-乳酸-甘油（PVLG），右侧滴一滴PVLG和Melzer's染液;用毛细管吸取孢子分别滴加到两侧;解剖针将孢子移至液滴中央，静置片刻，待水分挥发后，盖玻片小心盖在液滴上;在显微镜下边观察边小心压片，直至孢子破裂，能够清晰看到孢子壁、连点等结构;详细记录孢子壁的层数、厚度、纹饰等特征;对比相关网站（http：//invam.wvu.edu/，http：//www.amf-phylogeny.com）中性状的描述对AM真菌进行分类鉴定。

2.2 分子生物学鉴定法

虽然生理学鉴定法可直观依据不同形态特征对AM真菌进行分类，但也有工作繁琐、对制片要求较高、难以区分特征相近菌种和易受外界干扰等缺点。因此，分子生物学鉴定技术应运而生。具体操作为：采用Van Tuinen等描述[9]方法，提取AM真菌孢子DNA;然后采用Nested-PCR对DNA进行扩增，选用ITS1-NDL22引物进行;将扩增产物用无菌水稀释100倍，作为模板进行第二轮扩增;选用真菌通用引物LR1-NDL22进行，产物覆盖真菌25S rDNA中的D1/D2可变序列，长度约为750bp;将第二轮PCR产物回收测序;将序列上传NCBI网站进行BLAST分析，选取同源度较高的序列进行聚类分析，并构建进化树，根据进化树信息确定其种属关系。

与生理学方法相比，分子生物学方法可批量处理，较为方便快捷，受实验操作技术水平、外界环境和人为因素干扰较小，鉴定更为精确，但其成本相对较高，单个样品鉴定周期较长。

3 AM真菌的扩繁

3.1 盆栽扩繁法

在单孢培养完成后，可对AM真菌进行扩繁。传统方式为盆栽法[12]，具体操作为：取砂土容量为2-5kg的花盆，经10%次氯酸钠浸泡后洗净晾干;在盆中装入一半经灭菌处理的基质;剪去育苗盘中植物地上部，将剪碎的根系与基质混匀，均匀洒在扩繁花盆的基质表面;然后继续在盆中装满无菌基质;播种植物在低磷条件下扩繁。

3.2 毛根无菌扩繁法

除盆栽法扩繁，基于转基因毛根系统的无菌扩繁法也广为大家接受。该系统以可无限增值的Ri T-DNA转型根为宿主，无外源杂菌下对AM真菌进行扩繁培养。具体方法如下：首先采用董昌金等描述方法[13]对孢子进行表面灭菌，即筛取健壮孢子，吸入1.5ml离心管中;加200μl氯胺T（2%）、庆大霉素（0.01%）和链霉素（0.02%）的混合液，轻轻吸打混匀，静置10min;3000r/min离心2min，将液体吸走，无菌水洗涤3-5次;在25-27℃培养3天，使孢子表面的杂菌萌发生长;再重复上述灭菌过程;然后将处理好的孢子转移至MS培养基上，放置一小段胡萝卜的Ri T-DNA转型根，避光培养;约1-2个月后，根据培养皿中转型根和AM真菌长势，挖取一小块含真菌孢子的培养基，放置到新的MS培养基中进行传代培养。本方法全程均在超净台中进行无菌操作;本方法中对孢子进行的表面灭菌会部分影响萌发活性，因此每支离心管中孢子数最好不低于10个。

3.3 液体培养法

在菌根实验中，AM真菌的侵染常在固体中进行，但在部分需要洁净根系或需精密调控环境条件的实验中，固体培养很难达到预期要求。基于此，Debatosh Das等于2020年开发一套液体培养模式[14]。装置如下：取1.5ml枪头盒，用锡箔纸包裹避光;将枪头下端剪去1/3;取与修剪过枪头差不多长度的岩棉，把1/3长度的岩棉从枪头底部塞入枪头中，剩余2/3留在外面发挥“灯芯”作用;在枪头盒中加入实验所需营养液，将带有岩棉的枪头插入枪头盒，使岩棉浸到液体;将AM真菌的孢子接种到岩棉上;最后把提前育好的幼苗放入枪头中培养。在培养的过程中营养液注意通气，否则将影响AM真菌的侵染。除岩棉外，所有材料在经过高压灭菌后均可重复使用;如果是较大植物，可将枪头用50ml离心管替代，枪头盒用不透光的黑桶替代。

3.4 非共生培养法

Sachiko Tanaka等研究发现，在肉豆蔻酸和有机氮存在的情况下，独脚金内酯和茉莉酸盐结合可诱导Rhizophagus clarus HR1在非共生培养中产生大量可侵染性孢子[15]，这为AM真菌的扩繁提供了新技术和方法，为AM真菌非共生纯培养的实现提供了可能性。具体方法如下：分别配置100mM的肉豆蔻酸钾、0.1mM的独脚金内酯GR24和1mM的茉莉酸甲酯（MeJA）储备液，过滤灭菌;然后配置改良版的M培养基，除维生素外其余成分均溶于水，用KOH调节pH为6.5后采用高压蒸汽灭菌，再加入过滤灭菌的维生素;在无菌条件下边搅拌边加入脂肪酸盐和植物激素储备液，使肉豆蔻酸钾的终浓度为500μM、独脚金内酯GR24的终浓度为100nM、MeJA的终浓度为1μM;培养基冷却凝固后，表面接种20-30个无菌孢子，28℃暗培养6-8周可见大量的新生孢子出现。

随着科技发展，技术的进步日新月异。AM真菌非共生培养技术的发现为菌种的扩繁推开了一扇新的大门，目前报道技术虽摆脱了宿主植物的制约，但依然没有改变扩繁周期相对较长的现状，且基于Rhizophagus clarus HR1菌株的技术能否普适于其他菌种还有待进一步验证，因此AM真菌的扩繁培养技术仍需菌根工作者的进一步探索和完善。

参考文献

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基金项目：广州市科技计划（202102020229）和仲恺农业工程学院大学生创新基金（2020A27）资助项目

作者简介：梁杰锋（1998.12-），男，广东茂名人，在读本科生。