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摘要：对陕西某养殖场疑似猪流行性腹泻（PED）症状猪只小肠病料采集，并应用Vero细胞进行病毒分离，后通过RT-PCR检测、中和试验、S基因序列分析、病毒含量测定对病毒进行鉴定。结果显示，我们成功分离到一株猪流行性腹泻病毒（PEDV），命名为PEDV-WN。将PEDV-WN株F5代以不同剂量口服2.0ml接种7～10日龄健康仔猪，进行了致病性研究。结果显示，低剂量组4/5发病，中剂量和高剂量组均5/5发病，将PEDV-WN株F5代的最小发病剂量确定为口服接种2.0ml（104.5TCID50/ml）。本研究分离的PEDV-WN株为强毒株，为进一步对PEDV进行生物学研究及疫苗的研制奠定了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒WN株;分离鉴定;致病性

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一种高度接触性、高致死性肠道传染病[1-3]。1971年，PED首次在英国育肥猪上发现，直到1978年，Pensaert等人确认PED的病原是一种新的冠状病毒，正式将此腹泻病命名为猪流行性腹泻[4]。1984年，宣华等人首次证明我国猪群中PED的存在，他们应用猪胎肠单层细胞成功培养并鉴定了来自国内的多个PEDV毒株[5]，但此次疫病没有大规模爆发。直至2010年10月，我国南方部分猪场暴发PED，并逐渐蔓延至河南、河北、浙江、贵州、武汉等全国各地[6-7]，2010年以后，我国学者开展了大量关于PED的分子流行病学调研[8]。患病猪只临床特征以呕吐、腹泻、脱水、厌食为主[9]，各年龄段猪对该病毒均易感，其中7日龄内的哺乳仔猪症状最为严重，感染致死率高达90%～100%，给养猪业造成了极大的经济损失[10-11]。

由于管理水平的差异，单次疫苗接种后并不能保证产生有效的中和抗体[12]。加之近些年PED流行范围广、持续时间久，有变异株存在的风险，使得现有疫苗免疫保护力差异较大。大量PEDV分子流行病学研究显示，2010年～2016年间的PEDV流行毒株与CV777等疫苗株的同源性较低，尤其在毒力决定基因S上存在较多突变[13]。因此，研制能保护仔猪的安全高效的疫苗是十分有必要的。本研究从陕西某养殖场采集有腹泻症状3～5日龄仔猪的十二指肠，经过病毒分离鉴定，获得PEDV-WN株，并开展了PEDV-WN株致病性研究，以期为PEDV的生物学研究及疫苗的研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料、细胞及实验动物 3～5日龄疑似PED症状仔猪的十二指肠病料采自陕西某养殖场，Vero细胞由陕西诺威利华生物科技有限公司提供，7～10日龄健康仔猪（PEDV病原、抗体均为阴性）由陕西某养殖场提供。

1.1.2 主要试剂 PEDV特异性阳性血清、PEDV阴性血清均由陕西诺威利华生物科技有限公司提供，细胞培养液为含10%胎牛血清的MEM培养基、细胞维持液为含10μg/ml胰酶的MEM培养基、MEM培养基购自Hyclone公司、胎牛血清购自Gibco公司，RNA提取试剂盒购自Omega公司，反转录酶、dNTP、随机引物、DNA Marker DL2000均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 引物设计 根据PEDV CV777毒株M基因保守序列，设计并合成如下PCR引物：PEDV-F：AACGGTTCTATTCCCGTTGATG;PEDV-R：TAAATGAAGCACTTTCTCACTATC。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，预期扩增片段大小为645bp。

1.2 方法

1.2.1 病毒分离

将肠组织剪碎后匀浆，3000r/min离心5分钟，取上清用0.22μm的滤器过滤除菌，接种生长良好的单层Vero细胞，吸附1小时后，弃去病毒液，PBS清洗三次后，加入细胞维持液，置37℃、含5% CO2的培养箱中培养3日，观察是否出现细胞病变（CPE），如此盲传至CPE，收获培养物并命名，置-70℃以下保存备用。

1.2.2 病毒鉴定

1.2.2.1 RT-PCR检测 取细胞培养物，按RNA提取试剂盒说明书进行RNA提取，提取物进行反转录，后进行扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.2.2 病毒S基因序列分析 取出现CPE的细胞培养物，用随机引物反转录后的cDNA产物进行S基因测序，使用MEGA5.5软件进行S基因序列比对。

1.2.2.3 病毒中和试验 将分离到的PEDV病毒液稀释成200 TCID50/0.1ml，与等量的PEDV特异性阳性血清混合，置37℃作用60分钟，接种长成良好单层的Vero细胞96孔细胞培养板，接种4孔，100μl/孔，置37℃、含5% CO2的培养箱中培养7日，同时设阴性血清对照、正常细胞对照组和未中和病毒对照组，每日观察各组细胞病变情况。

1.2.2.4 病毒含量 将分离到的PEDV病毒液用MEM培养基作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5和10-6 4个稀释度，分别接种已长成良好单层的Vero细胞96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，100μl/孔，置37℃作用60分钟，弃去培养液，加入细胞维持液，100μl/孔，同时设正常细胞对照，置37℃、含5% CO2的培养箱中培养7日，按Reed-Muench法计算TCID50。

1.2.3 致病性研究

将20头7～10日龄健康仔猪分为4组，病毒原液分别进行10倍、100倍稀释，分为高、中、低3个剂量组，分别口服接种一组试验猪，2.0ml/头，对照组不接种，详见表1，攻毒后观察10日。

2 结果

2.1 病毒分离 病料接种Vero细胞后，盲传3代，置37℃，含5% CO2的培养箱中培养96小时后，产生细胞病变，表现为合胞体、细胞呈灶状脱落等，详见图1。再继续传至第5代，收获培养物，标记为PEDV-WN株F5代，置-70℃以下保存。

2.2 病毒鉴定

2.2.1 RT-PCR检测 提取细胞培养物总RNA，进行RT-PCR检测，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，得到大小约为645bp的目的条带，详见图2。该结果证明该分离毒株为PEDV。

2.2.2 病毒S基因测序及序列分析 将PEDV-WN株进行S基因序列测定，并与GenBank中公布的近几年PEDV流行毒株及经典毒株等11组S基因序列进行比对同源性在90.0%～96.7%。其中，我们分离到的PEDV-WN株与AJ1102、BJ-2011-C、PC21A、USA-Colorado-2013株S基因序列的同源性在96.1%～96.7%之间，与标准毒株CV777（AF353511.1）、弱毒疫苗株CV777（KT323979.1）和疫苗毒株DR13的S基因序列的同源性在90.0%～90.6%之间，差异性较大，详见图3。

2.2.3 病毒中和试验 将PEDV-WN株与PEDV特异性阳性血清中和后，接种Vero细胞。结果表明，病毒中和组及正常细胞对照组均不产生细胞病变，阴性血清对照组、未中和病毒对照组产生细胞病变。

2.2.4 病毒含量 PEDV-WN株F5代的病毒含量为105.5TCID50/ml。

2.3 致病性研究

将PEDV-WN株F5代以低、中、高3个剂量分别口服接种7～10日龄健康仔猪，攻毒后观察10日。结果表明，103.5TCID50/ml剂量组有4头猪出现腹泻症状，1头猪脱水，4/5发病，104.5TCID50/ml和105.5TCID50/ml剂量组均5/5出现腹泻症状，大部分猪伴有脱水，5/5发病，其中105.5TCID50/头剂量组有2头猪死亡，对照组均未出现腹泻症状，详见表2。

3 讨论

本研究通过对陕西某养殖场有腹泻症状的猪只十二指肠病料采集，并用Vero细胞进行病毒分离，经鉴定，该毒株经RT-PCR可扩增出预期大小为645bp的目的片段，能被PED特异性阳性血清中和，与近几年的PEDV流行毒株的同源性要高于目前市场上的CV777和DR13等株。以上结果表明，我们分离到了一株PEDV流行株，命名为PEDV-WN，病毒含量为105.5TCID50/ml。通过致病性研究可知，该毒株分别以103.5TCID50/ml、104.5TCID50/ml和105.5TCID50/ml的剂量，口服2.0ml接种7～10日龄健康仔猪，结果显示，103.5TCID50/ml剂量组4/5发病，104.5TCID50/ml和105.5TCID50/ml剂量组均5/5发病，PEDV-WN为流行强毒株。我们PEDV-WN株F5代的最小发病剂量确定为口服接种2.0ml（104.5TCID50/ml）。

PEDV作为冠状病毒，其基因组为稳定性较差的单股正链RNA病毒，易发生突变。此外，2010年以来我国大范围爆发PED，且PEDV还在不断变异，这种变异可能为PEDV的防控提出新的挑战，需加强该病原的流行病学研究，密切关注病原的遗传变异。因此，研究当前PEDV主要流行株为防控PED的发生具有重要意义[14]。

参考文献：

[1]殷 震，刘景华.动物病毒性[M].2版.北京：科学出版社，1997：688-690.

[2]洪声安.猪流行性腹泻病病毒的分离鉴定[J].中国动物保健，2012，14（5）：20-21.

[3]周作勇，胡世君.动物传染病学[M].重庆：西南师范大学出版社，2019：300-301.

[4]Pensaert M.B.，de Bouck P..A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine[J].Archives of Virology，1978，58（3）：243-247.

[5]宣 华，邢德坤，王殿瀛，等.应用猪胎肠单层细胞培养猪流行性腹泻病毒的研究[J].兽医大学学报，1984，（4）：202-208.

[6]Li W.，Li H.，Liu Y.，Pan Y.，Deng F.，Song Y.，Tang X.，He Q..New variants of porcine epidemic diarrhea virus，China，2011.Emerging infectious diseases，2012，18（8）：1350-1353.

[7]杜晓莉，王一成，吴润，等.2010-2013年浙江省猪流行性腹泻病毒临床检测及PEDV-S基因型分析[J].浙江农业学报，2014，26（03）：581-587.

[8]逯晓寒.猪流行性腹泻病毒流行毒株的分离鉴定及其分子特性分析[D].山东：山东农业大学，2021.

[9]吴 白，苏玮玮，鞠德财，等.猪流行性腹泻病毒SD201604株的分离鉴定及致病性研究[J].中国畜牧兽医，2018，45（11）：3229-3236.

[10]JUNG K，ANNAMALAI T，LU Z，et al，Comparative pathogenesis of US porcine epidemic diarrheavirus（PEDV）strain PC21A in conventional 9-day-old nursing piglets vs.26-day-old weaned pigs[J].Vet Micrbiiol，2015，178（1/2）：31-40.

[11]李公美，李茂辉，钱爱东，等.猪流行性腹泻病毒新型检测方法的研究进展[J].中国兽医学报，2020，40（3）：650-653，664.

[12]程 杰，栾 慧，吴家强，等.猪流行性腹泻新型疫苗的研究进展[J].养猪，2015（4）：97-101.

[13]郭振刚，胡江锋，王 婷，等.猪流行性腹泻病毒分离鉴定及其灭活疫苗的研制[J].动物医学进展，2021，42（2）：26-33.

[14]耿 超，陆泓宇，梁 婉，等.猪流行性腹泻病毒HB2018的分离鉴定及致病性[J].中国兽医学报，2021，41（9）：1704-1709.