打开文本图片集

摘 要：单克隆抗体作为一种细胞工程抗体，在临床医学、基础医学研究、食品卫生等领域的应用越来越被重视，临床应用常涉及肿瘤等疾病的诊断治疗、组织器官转移、药物制备等众多方面。本文以人源化CD38单克隆抗体研发为例，介绍了CD38单克隆抗体制备技术、抗人CD38鼠源抗体的人源化过程；并通过体外细胞学实验评估了该抗体的Facs 亲和力、ADCC、CDC等体外功能活性，证实了该抗人CD38人源化抗体有与市售抗体Daratumumab相似的体外功能活性，存在被开发成多发骨髓瘤疾病相关的治疗用抗体的潜质。

关键词：单克隆抗体；CD38；人源化；制备技术；实验；活性

引言

CD38在多发性骨髓瘤细胞（MM）上是均一性地高表达，却对于正常的淋巴细胞、一些非造血起源组织而言是呈现出低表达的。CD38属于跨膜糖蛋白，具有体外酶活性，同时还具有受体和粘连分子的作用。因而是MM治疗的理想靶点，基于其独特的作用机制、低毒性和单剂活性，CD38抗体也适用于联合方案。目前，国内外都在研发以CD38抗体来作为基础疗法，并将该疗法应用到高危MM患者治疗中，也取得了较好疗效。 除此之外，CD38抗体用于其他血液性恶性肿瘤（急性淋巴细胞白血病、NK/T细 胞淋巴瘤和急性髓性白血病）的治疗效果也在研究中。 本文基于杂交瘤技术基础上研发出的人源化CD38单克隆抗体来作为案例，浅要探究CD38单克隆抗体制备技术、抗人CD38鼠源抗体实现人源化过程，以及就研发的抗人CD38人源化抗体的体外结合亲和力和动力学实验进行分析，以供借鉴。

1 CD38单克隆抗体制备技术

1.1对照抗体制备

将全合成的Daratumumab，Isatuximab和Mor202抗体轻链可变区和重链可变区基因分别克隆至装了人-kappa以及人IgG1所具有的恒定区编码基因上游载体中，以获得Daratumumab，Isatuximab和Mor202轻，重链表达质粒，转入大肠杆菌扩增，分离获得大量含Daratumumab，Isatuximab和Mor202抗体轻链和重链的质粒，并将二者与PEI实行混合并载入到HEK293细胞内；而在细胞转染5-6天，取培养上清，利用Mabselect亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得Daratumumab，Isatuximab和Mor202抗体重组蛋白。

1.2抗原细胞株制备

共制备人CD38高表达CHO细胞1-T-14一株和人CD38低表达CHO细胞1-T-12细胞一株，具体结果见图1所示。

1.3小鼠免疫

小鼠免疫共选择了15只小鼠并分两组成；并采用传统免疫和快速免疫两个方法，传统免疫共10只小鼠，快速免疫5只小鼠，其中传统免疫分抗原免疫和细胞免疫两组，各5只。

其中，第一组小鼠采用弗氏佐剂在第零天和第二十一天向周龄处于8至10周的小鼠实施两次皮下免疫注射，第一次免疫剂量为75ug，第二次免疫剂量为50ug。免疫前取小鼠血清作为检测时的阴性对照，弗氏佐剂在初次免疫之后的第三十五天开展尾部静脉取血，用包被重组人CD38蛋白的96孔酶标板以ELISA法检测血清滴度。第二组小鼠采用细胞免疫，其实行的免疫方式为：用人CD38高表达株CHO-huCD38 1-T-14给8-10周龄Balb/c小鼠进行两次皮下腹腔注射，5E+6细胞/只，初次免疫后第三十八天取血清滴度高的小鼠身上取下的脾细胞用于下一步开展细胞融合。第3组小鼠是快速免疫小鼠，采用弗氏佐剂于第零天、第三天、第六天，第十二天，第十五天和第十八天向周龄处于8至10周的小鼠以一次多点的方式实施皮下免疫注射，首次使用的免疫剂量选择的是6ug，之后注射的的免疫剂量选择的都是3ug。免疫前取小鼠血清作为检测时的阴性对照，弗氏佐剂在初次免疫后第二十一天开展尾部静脉取血，用包被重组人CD38蛋白的96孔酶标板以ELISA法检测血清滴度。

1.4细胞融合和杂交瘤制备筛选

（1）骨髓瘤细胞准备

培养融合所需骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653在500ml三角培养瓶至细胞密度0.8-1.0E+6密度时，换液至完全杂交瘤培养基内以备需要时使用。

（2）淋巴结和B淋巴细胞制备

选取滴度达到要求的小鼠，将眼球摘除后开展采血工作，并把分离血清用于抗体检测阶段所需的阳性血清比对；并处于无菌环境内将小鼠脾脏取下，从而制备好B淋巴细胞悬液。将处死小鼠身上取下2个腿弯部淋巴结，2个腹股沟淋巴结和2个腰椎淋巴结，放入冰浴好的1ml培养基内，用注射器橡胶头研磨至形成均一细胞混合物后，用70uM的细胞过滤器过滤，加入5-10ml红细胞裂解液至混合液中，再加入20mlDMEM培养基，2000RPM离心5分钟，将细胞重悬与10mlDMEM中，合并脾脏B淋巴细胞悬液，再次用70uM的细胞过滤器过滤，进行细胞计数。

（3）电融合（Electro Cell Fusion，ECF）

骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653和淋巴B细胞以4：1的比例混合，2000RPM离心5分钟，用50ml等压的ECF溶液重悬细胞，再次离心并相同条件再次洗一遍混合细胞，然后用低渗透ECF溶液重悬细胞至密度为1E+6细胞/ml，将重悬好的细胞加入9ml电击杯内进行电击融合。电击参数设置如表1所示。

电击后，将细胞放入37度CO2培养箱内，静止30分钟，1000RPM，室温离心10分钟，用360ml杂交瘤选择培养基重悬细胞后，铺板至384孔板内，确保铺板的密度处于8000细胞/孔至20000 细胞/孔之间。第二至三天后实行一次换液，第七至十天则筛选出符合要求的阳性杂交瘤。

（4）阳性杂交瘤筛选（Facs）

将融合后的杂交瘤细胞384孔板中，取上清用FACS分析杂交瘤细胞分泌的抗体，筛选得到若干能够结合细胞表面稳定表达人CD38蛋白的CHOK1细胞而不能够结合细胞表面稳定表达人无关蛋白的CHOK1细胞的克隆。并采用有限稀释方式将筛选出来的克隆实行单细胞化，按照此方式进行3轮以后可以获得只能分泌出1个抗体的杂交瘤细胞。

1.5鼠源单克隆抗体的筛选

依据要求把能够分泌出抗人CD38抗体的杂交瘤细胞开展扩大培养之后，再根据规定开展细胞总RNA的提取；之后，再使用Takara）来把提取出来的RNA实施反转以制作成cDNA；同时采取简并引物以及Extaq PCR试剂来实现对抗体可变区序列的增殖；之后再使用专门的试剂盒开展增殖产物纯化作业；完成上述步骤后，再按照规定把扩增PCR产物与T载体实行连接，同时也对大肠杆菌的感受态细胞实施转化；最后，在菌株扩增以及抽提质粒后再开展DNA测序，以得到单克隆抗体所需可变区序列。

1.6抗人CD38嵌合抗体的制备

首先，把鼠源抗人CD38单克隆抗体所具有的重链恒定区序列拼接到人类单克隆抗体IgG1亚类所具有的重链恒定区序列上面，重新形成的序列再转接到哺乳动物细胞内进行繁殖，则得到了新的重链可变区序列；同时，将以上两种的轻链恒定区序列也按照上述方法进行拼接、转接、繁殖，最终也可以得到轻链可变区序列；完成上述步骤后，再把得到的新的重链载体以及轻链载体实施配对，并利用PEI来对HEK293细胞实施转染，一周时间之后再把细胞收集起来并上清，最后采取Mabselect实施纯化以获得抗人CD38嵌合抗体蛋白。

2抗人CD38鼠源抗体的人源化

完成上述步骤之后，即可进行抗人CD38鼠源抗体的人源化。其过程主要是：首先选择以被认知的人源抗体序列，在该系列中选出与鼠源抗体之间具有高度一致性的人源抗体重链可变区序列，例如IGHV1|IGHJ4*01；之后，再把该人源抗体所具有的框架与鼠源抗体所具有的重链（轻链）CDR实施拼接，从而得到了所需要的人源化抗体的重链（轻链）可变区序列；鼠源抗体CDR直接移植至人框架区的抗体常出现结合活性急剧下降，因此需要将框架区个别氨基酸从人源的改回鼠源的；之后再对回复突变位点进行确认，包括确认制作出来的人源化与最初鼠源之间的抗体序列是否存在不同氨基酸以及以上氨基酸在抗原结合、抗体结构支持上能不能起到关键作业，还有就是确认有没有存在类似于糖基化位点、异构化位点的修饰位点；完成以上过程后，则把得到了重链（轻链）基因移植到哺乳动物细胞内进行构建，再将构建得到的抗人CD38人源化抗体所具有的重链、轻链载体实施配对；其次，再利用PEI来对HEK293细胞实施转染，一周时间之后再把细胞收集起来并上清，最后采取Mabselect实施纯化以获得抗人CD38人源化抗体蛋白。

3抗人CD38人源化抗体的体外细胞学实验

获得的人源化抗体需通过抗体活性实验，以重复验证人源化改造抗体在CDC、ADCC方面的表现情况。

（1）Facs 亲和力

从图1中可知，CHO-hCD38 1-T-14和CHO-hCD38 1-T-12的Facs 亲和力与对照抗体Daratumumab相似。

（2）ADCC 活性

从图2中可知，CHO-huCD38抗体的ADCC活性和对照抗体Daratumumab相似。

（3）CDC 活性

从图3中可知，CHO-huCD38抗体的CDC 活性和对照抗体Daratumumab相似。

以上实验结果可知，证实了该抗人CD38人源化抗体有与市售抗体Daratumumab相似的体外功能活性。

结语

综上所述，为确保单克隆抗体医学功能的有效性，加强其制备技术的研究具有重要的现实意义。本文以人源化CD38单克隆抗体研发为例，利用杂交瘤技术制备并筛选出了鼠源单克隆抗体，之后再制备了抗人CD38嵌合抗体；并根据Germline数据库选取了人源化模板，并实施抗体序列人源化，从而获得了人源化抗体；最后再次通过体外结合亲和力和动力学实验评估其ADCC、CDC等体外功能活性，证实了该抗人CD38人源化抗体有与市售抗体Daratumumab相似的体外功能活性，进而推测其有潜在被开发成多发骨髓瘤疾病相关的治疗用抗体。

参考文献：

[1]周远清.人源化抗CD38抗体制备及生物学功能研究[D].华南理工大学硕士学位论文，2017.

[2]何妍，王华菁，陆婷，等.激活型人源化抗人CD137单克隆抗体的研制与生物学活性鉴定[J].安徽医科大学学报，2018，53（09）：1332-1337.

[3]沈立军，孔永，颜天铭，等.鼠抗人CD28单克隆抗体的制备及体外生物学活性的初步研究[J].中国免疫学杂志，2019，35（18）：2253-2257.

[4]王蓉，李良，张胜华，等.抗人CD30单克隆抗体的制备和活性研究[J].中国医药生物技术，2018，13（05）：395-403.

[5]陈大伟，徐秀章，夏文杰，等.一株鼠抗人CD36单克隆抗体的制备及应用[J].广州医药，2020，51（04）：28-31.

作者简介：任红媛1981.10，女，籍贯：陕西延安，汉，硕士，研究方向：抗体药物研究