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摘 要：Fmoc-Ile-OH是合成多肽的重要原料，其原料药对杂质鉴定限是小于0.1%，质控限度＜0.15%，控制有关物质限度单杂0.1%的，大大减少药企的工艺研究和质量研究的时间以及成本，所以Fmoc-Ile-OH的有关物质研究和控制对原料药和制剂的质量研究都有重要意义。

关键词：Fmoc-Ile-OH；有关物质；检测方法；方法研究

引言

Fmoc-L-异亮氨酸;N-芴甲氧羰基-L-异亮氨酸，用于生化试剂，多肽合成。

英文名称： Fmoc-Ile-OH

英文别名：N-（9-Fluorenylmethoxycarbonyl）-L-isoleucine ;Fmoc-L-

isoleucine

CAS号： 71989-23-6

分子式： C21H23NO4

又名2-氨基-3-甲基戊酸，是一种有机化合物。化学式为C6H13NO2。是脂肪族中性氨基酸的一种，有旋光性，能够提高体能，帮助修复肌肉组织，形成血红蛋白，所以是人体所需的，价格也比较高的一种氨基酸。以用量计占第二位，以金额计占第一位，异亮氨酸的可以对预防骨质疏松症，对缺钙的人群也能够达到一定的缓解效果。此外，异亮氨酸还对脑损伤有一定的好处，因为其中含有的成分有助于大脑细胞修复受损部位，从而提高记忆力，它能够更快的分解转化为葡萄糖，增加葡萄糖可以防止肌肉组织受损。此外，L-异亮氨酸在多个领域都有使用，包括农业、生物学技术、材料学、工业、氨基酸化学、环境保护和科研领域等。[1-2]。

Ile分子有2个手性中心，具有4个立体异构体，分别为（2S， 3S）L-异亮氨酸（L-Ile）、（2R， 3R）D-异亮氨酸（D-Ile）、（2S， 3R）L-别异亮氨酸（L-allo-Ile）和（2R， 3S）D-别异亮氨酸（D-allo-Ile）

1项目概况

ICH Q11 中重点突出了起始物料的质量控制，尤其是关注了起始物料选择的合理性，还着重说明了起始物料杂质谱研究的必要性，了解它们在生产过程当中的作用，以及它们与最终原料药中有关物质之间的关联。生产多肽过程中，各种保护氨基酸的产品品质直接影响终多肽原料药的质量，应认定为关键的起始原料，并建立严格的质量标准。对于保护氨基酸企业制定的内控标准中，除常规的外观性状、溶解度、手性、熔点、比旋度、纯度项目以外，还应该开展氨基酸的杂质谱的研究[3]。加强保护氨基酸的杂质谱分析，同时建立严谨的原料质量标准，会降低最终多肽原料药的杂质研究难度，提高产品纯度，非常有促进意义，也更安全和经济。

Fmoc-Ile-OH是合成多肽的重要原料，其原料药对杂质鉴定限是小于0.1%，质控限度＜0.15%，控制有关物质限度单杂0.1%的，大大减少药企的工艺研究和质量研究的时间以及成本，所以Fmoc-Ile-OH的有关物质研究和控制对原料药和制剂的质量研究都有重要意义。

Ile与Leu是同分异构体，把亮氨酸侧链的异丁基换成了仲丁基，亮氨酸的 γ位有个甲基，后异亮氨酸的β位有个甲基。Ile与Leu是结构差异很小的同分异构体氨基酸。因此Fmoc-Leu-OH的有关物质之一Fmoc-Ile-OH分离难度尤其大。

2仪器与材料

反相高效液相色谱仪：品牌是赛默飞，型号是U3000，配置了四元泵，带自动进样器，紫外检测器，Chromeleon 7工作站，十万分之一的电子天平，品牌是赛多利斯，型号是BT25S，C18柱，4.6mm×250mm，5µm；C12柱，4.6mm×250mm，5µm；C4柱，4.6mm×250mm，5µm。Fmoc-Ile-OH（吉尔生化），杂质Fmoc-β-Ala-OH（吉尔生化），杂质Fmoc-β-Ala-

Leu-OH（吉尔生化），杂质Fmoc-Leu-OH（吉尔生化），Fmoc-Ile-Ile-OH（吉尔生化），乙腈（色谱纯，国药），三乙胺（AR，国药），KH2PO4（AR，国药），三氟乙酸（AR，国药），重蒸馏水（自制）。

3方法与结果

3.1 涉及到的杂质结构列表

3.2实施方案1

筛选了色谱柱包括C4色谱柱、C12色谱柱以及C18色谱柱；洗脱时的色谱柱的柱温为22～45℃，进样浓度控制在0.4～1.0mg/min，紫外线检测器的检测波长为210～280nm，流动相流速为0.6～1.2ml/min。

检测流程如下：

将蒸馏水和0.1%TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相A；将乙腈和0.1%TFA的离子对溶液按一定比例配置流动相B；注入待测溶液，以流动相A和流动相B对色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱的柱温为40℃，进样浓度控制在0.5mg/ml，流动相流速为0.8ml/min，所述梯度洗脱时紫外线检测器的检测波长为220nm。记录色谱图，并采用面积归一化法计算Fmoc-Ile-OH的纯度。

色谱条件采用如表2所示：

洗脱条件如表3所示：

注入Fmoc-Ile-OH（吉尔生化），杂质Fmoc-β-Ala-OH（吉尔生化），杂质Fmoc-β-Ala-Ile-OH（吉尔生化），杂质Fmoc-Ile-Ile-OH（吉尔生化），Fmoc-Leu-OH（吉尔生化）的混合溶液，以及分别单独进样，从图3看，5个峰成功分离，分离度分别为11.39、17.79、1.64和5.31，均符合符合分离度不低于1.5的标准，其中最难分离的Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH分离度也能达到1.64。

该方法能够很好的分离Fmoc-Leu-OH的4个有关物质，从而有效的控制Fmoc-Ile-OH的纯度。

3.3对比例的检测

3.3.1对比例1

检测流程如下：

将适量三乙胺溶于蒸馏水，再加适量的磷酸调pH得到2～2.5的流动相A为80mm TEAP ；色谱乙腈为流动相B；注入待测溶液，以流动相A和流动相B对色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱的柱温为40℃，进样浓度控制在0.5mg/ml，流动相流速为0.8ml/min，所述梯度洗脱时紫外线检测器的检测波长为220nm。记录色谱图，并采用面积归一化法计算Fmoc-Ile-OH的纯度。

色谱条件采用如表4所示：

洗脱条件如表5所示：

注入Fmoc-Leu-OH（吉尔生化），杂质Fmoc-β-Ala-OH（吉尔生化），杂质Fmoc-β-Ala-OH（吉尔生化），杂质Fmoc-β-Ala-Leu-OH（吉尔生化），杂质Fmoc-Leu-Leu-OH（吉尔生化），Fmoc-Ile-OH（吉尔生化）的混合溶液，以及分别单独进样，从图4看，有5个峰，分离度分别10.50，33.84，0.8和6.58，其中Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH分离度只有0.8，不符合分离度不低于1.5的标准。

3.3.2对比例2检测

检测流程如下：

将定量KH2PO4溶于蒸馏水按一定比例配置流动相A；色谱乙腈为流动相B；注入待测溶液，以流动相A和流动相B对色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱的柱温为40℃，进样浓度控制在0.5mg/ml，流动相流速为0.8ml/min，所述梯度洗脱时紫外线检测器的检测波长为220nm。记录色谱图，并采用面积归一化法计算Fmoc-Ile-OH的纯度。

色谱条件如表6所示：

洗脱条件如表7所示：

注入Fmoc-Ile-OH（吉尔生化），杂质Fmoc-β-Ala-OH（吉尔生化），杂质Fmoc-β-Ala-Ile-OH（吉尔生化），杂质Fmoc-Ile-Ile-OH（吉尔生化），Fmoc-Leu-OH（吉尔生化）的混合溶液，以及分别单独进样，从图5看，有5个峰，但其中Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH分离度比较小，未能完全分开。

4讨论

4.1实验结果讨论

实施方案1与对比例1，对比例2相比，实施方案1流动相体系选择TFA为添加剂，ACN，H2O的常规体系，对比例1采用三乙胺的缓冲盐体系，对比例2采用了H3PO4调节流动相的PH，梯度也各不相同，实验结果证明实施方案1能得到较优的结果，结果既快速又有效。

4.2 C4色谱柱的应用

色谱柱是HPLC分离过程中的核心，而反相色谱柱其分析能力强，筛选了色谱柱包括C4色谱柱、C12色谱柱以及C18色谱柱；C4（丁基）高效液相色谱柱有多种孔径，更低的疏水性，适于快速分离。C4 色谱柱提供与C18和C12相似的选择性，但保留更低。以同样的高纯硅胶作为基质，C4色谱柱能提供良好的峰形；更短的链长和更低的疏水特性使C4成为保留和分离疏水性多肽和蛋白质的理想固定相。

将C4色谱柱与C12色谱柱以及C18进行了实验对比，项目最终选择了C4色谱柱。

4.3效益分析

最终用C4色谱柱，区别常规的C18柱以及有效的流动相体系和梯度，能够将Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH从混合溶液中分离出来，并且成功分离了Fmoc-Leu-OH的4个有关物质（Fmoc-β-Ala-OH，Fmoc-β-Ala-Leu-OH，Fmoc-Leu-Leu-OH，Fmoc-Ile-OH），其中Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH的出峰时间分别为23min和24min，分离度能达到1.56，检测速度与现有技术相比更加快，结果更准确，方法步骤简单，便于操作，具有广阔的应用前景。

5结束语

公开号为CN104345114A［4］的中国专利公开了一种反相分离衍生化亮氨酸和异亮氨酸的方法，虽然样品能够分离，但Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH出峰时间均在40分钟左右，色谱分析时间长，且分离度小于1.5。因此，目前亟需一种检测时间较短，对相关物质分离度较好的Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法。

项目解决的技术问题，提供一种操作快捷、结果准确，方法步骤简单，便于操作的Fmoc-Ile-OH的有关物质检测方法，成功分离了Fmoc-Ile-OH的4个有关物质，Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH出峰时间23min和24min，分离度远远大于1.5，即使最难分离的Fmoc-Leu-OH与Fmoc-Ile-OH分离度也能达到1.64。

参考文献：

[1]SUZUKI M ，OWA S ，KIMURA M，et al .Supramolecular hydrogels and organogels based on novel，L-valine and L-isoleucine amphiphiles [J].Tetrahe-dron letters ， 2005 ，46 （2 ） ：303-306 .

[2] SUZUKI M ，SATO T ，KUROSE A ，et al .New low molecular weight gelators based on L-valine and L-isoleucine with various terminal groups[J] .Tetrahedron letters ，2005，46（2） ：2741-2745 .

[3]胡玉玺， 蒋煜， 韩天娇. 制备工艺和过程控制对合成多肽药物有关物质的影响[J].中国新药杂志，2017，26（18）：2143-2148.

[4]朱莉，徐红岩，闫峰，徐金勇，吴福全.一种FmocIleOH的有关物质检测方法[P].中国专利：CN104345114B ，2023-09-29

作者简介：朱莉，女，汉族，1981.09-，江苏镇江人，本科，工程师，研究方向：化学检测