打开文本图片集

摘 要：药物多肽之卡贝缩宫素的一种固相合成方法，概述了生产工艺、影响因素、质量控制等研究情况，分析讨论了多个环节的优缺点。对卡贝缩宫素合成，切割，环化，制备等工艺环节进行较全面的研究，从环化得率13%，通过多次方案多次试验，提高环化得率67%-70%之间。

关键词：卡贝缩宫素；固相合成；药物多肽；质量控制

引言

多肽药物是21世纪最有发展前途的药物之一。其因适应症广、安全性高，效果显著，已应用于癌症、个性化治疗、糖尿病、心血管等疾病的预防、诊断和治疗，有着广泛的发展潜力。

在中国，由于受到技术条件，原料以及硬件设施设备跟不上，可以大规模生产多肽类药物的企业少之又少，基本以国外进口品牌为主，国内药物多肽也以仿制国外的已过专利保护期的老品种为主，市场还未成熟，还有很大的发展空间。

卡贝缩宫素别名醋酸卡贝缩宫素、卡比托辛，化学名称（去氨-2-氧-甲基酪氨酸-1-κ缩宫素，是一种肽类激素，，药理作用与缩宫素相似，临床上卡贝缩宫素注射液可以用于硬膜腔外麻醉或者蛛网膜下腔麻醉的剖宫产术后，可加强子宫收缩力，预防因子宫收缩乏力而引起的子宫大出血，比老产品缩宫素效果快，持续时间长，临床应用更推荐［1-2］。

1项目概况

项目开始前进行了卡贝缩宫素的专利分析，针对现有公开报道的合成专利进行技术分析。从而设计出自拟开发工艺技术路线。根据本品原料药质量标准，分析其涵盖的信息，明确开发的策略和质量控制的方法。采用自拟的工艺技术路线，安排技术中心初步合成出产品，并初步进行结构确证。对工艺研究方面考察不同的树脂、切割方式、环化方式带来的影响。针对纯化和冻干的工艺参数进行研究；自备原料药的杂质标准品，对于自制标准品进行标化。

2卡贝缩宫素的工艺研究

卡贝缩宫素在分子结构上与缩宫素有所区别，卡贝缩宫素是九肽类似物，在缩宫素结构上进行了改善，例如去氨基化、去二硫键、羟基甲酯化。正因为分子结构的修饰，使卡贝缩宫素分子能避免氨基肽酶的裂解［3］，因此卡贝缩宫素的代谢稳定性比缩宫素强。

2.1工艺流程

合成-切割-环化-制备-冻干，工艺流程图

采用固相合成法，Rink-Amide-Am Resin按序列卡贝缩宫素的序列，逐个将氨基酸连接到树脂上，然后再将其从树脂上裂解下来，得到线性肽，然后进行环化，通过制备色谱进行制备，冻干。

2.2工艺中对质量的影响因素

2.2.1树脂的选择和链接

Rink-Amide-MBHA Resin ，Rink-Amide-Am Resin。

树脂接氨基酸前，最好加二氯甲烷溶胀，这样体积变大能够更好的接触反应，有利于反应完全，如果有未反应完全的，可以采用封端反应，这样可以避免掉C端缺失肽杂质的产生[4] 。

2.2.2 切割液的选择

切割是生产多肽中的一个步骤，从化学的角度来说，就是把多肽从树脂上分离并去掉多肽侧链和主链多余的临时保护基团。

切割反应考察了2-3小时左右，室温，且要不停地震荡。反应完成后抽滤，缓慢滴加低温的乙醚，搅拌有多肽析出，然后离心，离心3次之后的肽，各种侧链保护基团基本被乙醚洗涤了，再加入乙醚洗涤沉淀。此处低温保存后的乙醚效果更好，细节处理的好，能够提高20-30%的收率，得到线性肽即还原型粗品。

2.2.3 环化

环化可以在固相上进行，也可以在切割下来之后的液相上进行。

例如用水溶解，调节至pH7.5-10.5，再通过空气氧化或双氧水进行氧化，获得氧化型粗品；

最后采用C18柱进行分离纯化，得到目标产物。

2.2.4 制备

多肽的分离纯化方法以液相色谱法居多，例如高效反相液相色谱法、分子排阻法，亲和色谱法、离子交换色谱，项目卡贝缩宫素的分离纯化采用反相液相色谱法，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液，并用HPLC 转盐法交换转成醋酸盐，将最终的高纯度卡贝缩宫素肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥，得粉末状成品肽。

3质量控制措施

目前，国内外药典记载的多肽药物，质量标准中测试的项目基本包括外观、红外、比旋光度、酸度、溶解度、氨基酸组成、残留溶剂、醋酸、三氟乙酸、水分、内毒素、有关物质、含量等。

多肽类药物合成过程中可能产生的杂质有差向肽、缺失肽和错接肽等杂质，难度点在于很多杂质的分子量、结构与目标物在和化学性质上很相近，如果采用常用的萃取、重结晶等提纯很难得到合格产品或收率非常低。有关物质对多肽药物的安全性、有效性具有直接影响，是产品的关键质量核心，同时也是开发产品和技术评审会关注的重点方面[4]。

对于有关物质，也就是杂质的研究是药物肽的重中之重。那么如何做好药物肽的杂质分析，首先最关心的就是药物肽主峰前后的杂质是否能够有效的分离。如果杂质被主峰包裹或者拖尾，那么对杂质的定量就会变得不准确，对产品的质量确认就会存在极大的疑点。

项目研究了水解杂质、差向肽、缺失肽、非对映异构体、β-消除、氧化肽、线性肽等9个杂质，与进口注册标准提及的9个杂质相符，并将杂质合成出来。

现行版的欧洲药典中多肽药物的有关物质的限度，规定报告限为0.1%、鉴定限0.5%和界定限1.0%［5］。

3.1 有关物质检测方法

采用液相色谱法，色谱检测条件参照含量测定项下的条件，精密量取含量测定项下供试品溶液40μl，进样注射进液相，并记录色谱图。以面积归一化法计算，[D-Cys6]卡贝缩宫素不得过0.5%；[Des-Gln4]卡贝缩宫素不得过0.5%；其他最大单个杂质不得过0.3%；总杂质不得过2.5% ，。

3.2含量测定方法

色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充（如型号Waters XBridge C18，长度15cm，管径3.0mm，粒径3.5μm孔径120A 或等效色谱柱）；以醋酸铵缓冲液（取醋酸铵0.3g，加水1000ml使溶解，加380ml 乙腈和8mlPIC®B-8 低UV 试剂，加水稀释至2000ml）为流动相A，取等体积流动相A和乙腈混匀，作为流动相B；流速为0.8ml/min；波长220nm；柱温60℃。按下表进行梯度洗脱。

取卡贝缩宫素对照品，加稀释溶液1（取醋酸铵0.40g，加水溶解，加6ml 稀醋酸（2%），加水稀释至1000ml）溶解，制得浓度为0.1mg/ml的对照品溶液；用玻璃移液管精确移取2.0ml对照品溶液至20ml容量瓶中，加入4ml乙腈，加稀释溶液1定容，从中用玻璃移液管精确移取2.0ml至200ml容量瓶中，加40ml乙腈，加稀释溶液1 定容作为定量限溶液。精确吸取对照品溶液、定量限溶液、峰鉴别溶液（企业提供）各40μl，进样，记录色谱图，对照品溶液中卡贝缩宫素保留时间应不早于14分钟，拖尾因子应不得过2，定量限溶液中卡贝缩宫素色谱峰的信噪比应不得小于10，峰鉴别溶液中卡贝缩宫素峰与[D-Asn5]卡贝缩宫素峰之间的分离度应不得小于2.0，其它任何两个色谱峰之间的分离度应不小于1.5。峰鉴别溶液色谱图见图3。

测定法：取本品，精密称定，加稀释溶液2（取氯化钠9.0g，加900ml水充分溶掉，加稀醋酸（2%）调节pH 值范围在4.0±0.2，最后加水到1000ml，即得）溶解并稀释配成每1ml中含0.1mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液40μl，进样，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得结果。

3.3工艺中的质量控制措施

3.3.1工艺材料

Rink-Amide-MBHA Resin ，Rink-Amide-Am Resin均可，虽然MBHA效果相对较好，但MBHA树脂更贵，权衡性价比，最终选定Rink-Amide-Am Resin。

3.3.2工艺方法

3.3.2.1 切割

考察了几种切割液切割的效果：

（1）三氟乙酸（TFA）：三异丙基硅烷（TIS）：1，2-乙二硫醇（EDT）：H2O=82.5：5：2.5：5

（2）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=86.5：3：5：3：2.5

（3）TFA：H2O=95：5

（4）TFA：H2O：TIS=95：2.5：2.5

其中EDT，气味较大，对人体机环境仍有较大的伤害，且得到的粗品肽有不易处理的杂质。

3.3.2.2环化

氧化过程中选择空气来进行环化反应，反应温和，易于控制，但效率偏低；双氧水进行环化反应，则反应更快、效率更高，但如果没有严格控制双氧水的浓度则会造成反应过于剧烈，从而发生二聚甚至三聚现象。

3.4杂质分离

制备型液相色谱仪，C18的制备柱内径30mm，粒径5um，长度250mm，孔径120A，用合适的梯度收集制备，并由三氟醋酸盐转醋酸盐形式，冻干保存。

3.5自制标准品的标化

对自制标准品做了多肽结构确证，含核磁共振谱、序列分析、质谱、氨基酸分析、红外光谱、紫外光谱、比旋光度、水分、三氟乙酸含量、醋酸含量等分析。

4结束语

根据卡贝缩宫素进口原料药质量标准，拟定的工艺技术路线，并进行结构确证。对工艺研究方面考察不同的树脂、切割方式、环化方式带来的影响。针对纯化和冻干的工艺参数进行研究；自备原料药的杂质标准品，对于自制标准品进行标化。

在项目过程中，工艺研究中放大量的切割且保质保收率是个难点，通过调整切割液组成，切割反应时间，清洗细节等，稳定了切割后粗品的收率和纯度；环化是个难点和重点，从环化得率13%，通过多次方案多次试验，提到环化得率67%-70%之间。

有关物质的研究，这是合成药物肽的审评重点，也是技术审评的核心。对于有关物质，也就是杂质的研究是药物肽的重中之重。做好药物肽的杂质分析，首先最关心的就是药物肽主峰前后的杂质是否能够有效的分离。如果杂质被主峰包裹或者拖尾，那么对杂质的定量就会变得不准确，对产品的质量确认就会存在极大的疑点，在方法开发时研究了多肽合成做各个环节可能的杂质，并合成或制备出来，用于有关物质的研究。结合近20年的一线工作经历（多肽合成，氨基酸检测分析，多肽项目的杂质研究，第三方检测）接近了合成，切割，环化，分析中的以上难点，圆满完成了卡贝缩宫素的工艺研究和质量研究的项目。

参考文献：

[1]MCDONALD SJ，PRENDIVILLE WJ，BLAIR E.Randomized controlled trial of oxytocin alone versus oxytocin and ergometrine inactive management of third stage of labour[J].BMJ，1993，307（6913）：1167

[2]滕莉荣，边旭明，瞿桂荣，等.选择性剖宫产术后出血的药物控制研究[J].生殖医学杂志，2007，16（2）：73

[3]ESBER EC.An overviews of the strengths and limitations of biological assays in quality control[J].J Pharm Biomed Anal，1989，7（2）：131

[4]胡玉玺， 蒋煜， 韩天娇. 制备工艺和过程控制对合成多肽药物有关物质的影响[J].中国新药杂志，2017，26（18）：2143-2148.

[5]Ph.Eur.，General Guidance 2034，Substancesfor Pharmaceutical Use[S].2015.

作者简介：朱莉，女，汉族，1981.09-，江苏镇江人，本科，工程师，研究方向：化学检测