摘要：目的 探究丁苯酞对一氧化碳中毒迟发性脑病（Delayed encephalopathy after carbon monoxide poisoning，DEACMP）小鼠海马组织内小胶质细胞活化及炎症因子表达的作用机制。方法 筛选认知功能正常的C57成年野生型小鼠，随机分为三组：一氧化碳中毒迟发性脑病组（DEACMP组）、对照组（Control组）及丁苯酞治疗组（NBP组），DEACMP组与NBP组用CO吸入法制作模型。中毒后连续21天给予NBP组丁苯酞（6mg/kg/天，每日一次）灌胃，给予Control组与DEACMP组等量同次植物油灌胃。21天后行HE染色观察小鼠海马组织损伤情况，用Western Blot法测定Iba1蛋白表达情况，用Elisa法检测下游炎症因子表达情况。结果 1.Morris水迷宫：DEACMP组较Control组逃避潜伏期延长，差异具有统计学意义（P=0.001）；NBP组较DEACMP组逃避潜伏期减短，差异有统计学意义（P=0.025）。2.HE染色：Control组海马组织神经元排列整齐，形态规则，结构清晰；DEACMP组较Control组海马组织细胞数减少、结构紊乱不清、可见坏死细胞；NBP组较DEACMP组神经元细胞损伤程度均减轻。3.Elisa实验结果：DEACMP组较Control组IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平升高，差异有统计学意义（P=0.001、P=0.002、P=0.001）；NBP组较DEACMP组IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平降低，差异有统计学意义（P=0.034、P=0.028、P=0.037）。结论 丁苯酞可通过抑制小胶质细胞活化，减少炎症因子表达，减轻DEACMP带来的认知功能障碍及脑损伤。

关键词：一氧化碳中毒；迟发性脑病；小胶质细胞；炎症因子；丁苯酞

一氧化碳（carbon monoxide，CO）中毒是中毒性死亡常见原因之一，DEACMP是最严重且常见的神经系统后遗症。小胶质细胞（microglial cell，MG）是负责维持中枢神经系统的正常生理功能及对损伤产生局部反应的免疫细胞。利用MG为靶点抑制神经炎症，继而改善甚至逆转神经系统疾病病理过程的观点备受追捧。丁苯酞（butyphthalide，NBP）能重建微循环，保护线粒体。本实验将探讨DEACMP的发病机制和NBP对DEACMP是否具有保护作用及其机制，为临床诊疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组

选用120只健康成年C57BL/6小鼠，周龄约6-8周，清洁级，饲养于室内12h明暗交替，室温18～23℃，标准小鼠饲料喂养，不限制进水进食。采用随机数字表法将120只小鼠随机分为Control组（不中毒，植物油灌胃21天，40只），DEACMP组（中毒，植物油灌胃21天，40只），NBP组（中毒，丁苯酞与植物油制成的丁苯酞混合溶液灌胃21天，40只）。实验流程与动物处置均符合国家实验动物规范。

1.2Morris水迷宫实验

小鼠的空间学习及记忆能力可通过Morris水迷宫实验检测。Morris水迷宫在圆形容器（120cm×50cm）中进行，容器中装满含有食品级二氧化钛的水（22±0.5℃）。水池四周挂环形且有多个黑色标识的围帘。将泳池分为四大象限同时标记小鼠入水点，顶部放一摄像机监控。在4个象限中的1个象限下1cm处放置实验平台。提前一天让小鼠适应水迷宫环境，再进行5天正式实验，取4次训练潜伏期的平均值为其最终学习成绩。在中毒前筛选出认知功能合格的小鼠，在中毒后21天再次进行测试，记录各组小鼠平均逃避潜伏期。

1.3HE染色

经常规麻醉灌注，将脑组织放于4%多聚甲醛中后固定，再通过常规石蜡包埋法制备脑组织切片（8μm）。浸泡于二甲苯中脱蜡、酒精梯度清洗、水化、苏木精染色、水洗、分化、水洗、伊红浸染；常规脱水、透明、封片。再于光镜下观察各组小鼠脑细胞形态结构。

1.4统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行数据处理与统计学分析。符合正态分布计量资料以均值±标准差（x±s）表示，采用因素方差分析方法分析法（ANOVA）分析三组间水迷宫实验逃避潜伏期、小鼠海马组织锥体细胞计数、海马组织中Iba1表达水平、小鼠海马组织中Iba1平均荧光强度以及炎症因子相对蛋白表达水平差异，并使用事后检验LSD法进一步组间比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris水迷宫

在造模21天后，三组水迷宫实验逃避潜伏期有显著差异（P＜0.05）。组间比较发现，DEACMP组较Control组逃避潜伏期延长，差异具有统计学意义（P＜0.05）；NBP组较DEACMP组逃避潜伏期减短，差异有统计学意义（P＜0.05），NBP组较Control组逃避潜伏期延长，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 HE染色

三组小鼠海马组织锥体细胞计数有显著差异（P＜0.05）。组间比较发现，DEACMP组小鼠海马组织神经细胞数量较Control组减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；DEACMP组小鼠海马组织神经细胞数量较NBP组减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；NBP组小鼠海马组织神经细胞数量较Control组减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 Elisa法测定小鼠海马组织中TNF-a、IL-6、IL-1B的表达

组间比较发现，DEACMP组较Control组小鼠海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；DEACMP组较NBP组小鼠海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。NBP组较Control组小鼠海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

DEACMP的治疗以高压氧为主，急性CO中毒和DEACMP的发病与脑损伤和二次损伤很相似，这符合DEACMP“假愈期”的发病特点和病程早期的病理损伤。本次实验通过HE染色发现：与Control组相比，DEACMP组小鼠海马组织神经细胞肿胀、数量减少、细胞层数减少、排列紊乱、疏松，出现部分呈三角形或多边形的坏死细胞，部分细胞还出现核固缩、核溶解。通过Morris水迷宫实验发现：在造模21天后，DEACMP组较Control组逃避潜伏期延长，运动轨迹明显混乱呈随机式，表明DEACMP组小鼠出现认知障碍，记忆力减退；DEACMP组较NBP组逃避潜伏期延长，其轨迹也较NBP组混乱，由此可见NBP在治疗DEACMP引起的认知障碍有一定效果；但Control组较NBP组逃避潜伏期减短，且Control组轨迹呈趋向式，没有NBP组小鼠轨迹混乱，说明NBP虽然对治疗认知障碍有效，但不能完全治愈，可能还存在其他机制介导认知功能障碍。

综上所述，见NBP对DEACMP所导致的脑损伤具有治疗潜力，其中MG介导的炎症也在疾病发病机制中起重要作用。