作者简介：刘志灵、1991年2月、女、汉族、重庆市万州区、本科、护理学和中医药学研究。

摘要：脑缺血再灌注损伤（Cerebral Ischemic Reperfusion Injury， CIRI）是脑血管疾病研究的难点之一。它主要是由氧化应激诱导的过度自噬引起的。此前，发现了一种新型化合物X5，其优异的抗氧化活性在本研究中得到了验证。此外，网络药理学分析表明，化合物X5与自噬和mTOR通路密切相关。在体外，X5能显著抑制H2O2诱导的自噬蛋白Beclin-1和LC3-β的表达，促进SIRT1的表达。在体内，化合物X5可显著降低大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型的梗死面积，改善神经功能评分。综上所述，ros诱导的自噬与mTOR、SIRT1等密切相关，X5有望成为治疗CIRI的候选基因。

关键词：网络药理学；分子对接；作用机制；ROS；CIRI

中图分类号：R932     文献标识码：A

前言

中风是一种常见的脑血管疾病，由于其高死亡率和致残率，给家庭和社区带来了巨大的压力。大约80%的卒中病例归因于缺血性卒中。重组组织型纤溶酶原激活剂静脉溶栓是缺血性卒中最有效的治疗方法；然而，由于其治疗窗口狭窄，高死亡率和致残率仍然是一个挑战。这可能主要是由于溶栓后的血液再灌注导致一系列有害的继发性事件，即脑缺血再灌注损伤（CIRI）。过量活性氧（ROS）诱导的氧化应激作为CIRI的核心机制之一，已被广泛讨论。这是因为过量的ROS会通过氧化蛋白质、DNA和RNA导致细胞功能障碍和死亡，从而导致脑组织损伤。值得注意的是，最近有研究表明，氧化应激诱导的过度自噬在脑损伤中起着关键作用。在多种真核生物中，自噬是一种细胞防御机制，以“自我吞噬”为特征，在细胞成分的基本更新中起关键作用，并对细胞器损伤和营养剥夺做出积极反应。然而，氧化应激诱导的过度自噬可诱导细胞凋亡，加重脑损伤。因此，减少氧化应激诱导的自噬可能为预防和治疗CIRI提供新的治疗策略。网络药理学最初由Hopkins提出，是一种结合高通量数据集成、数据库检索、数据挖掘、靶标预测和计算机实验的方法。理论上，它可以在网络水平上分析小分子的作用方式，从而对其机制、功效和毒性进行分析和预测。此外，它还有助于设计具有更好治疗效果和临床安全性的新型药物。我们设计了一种新的抗氧化化合物X5来研究氧化应激诱导的自噬机制。随后，我们通过网络药理学和实验验证相结合的方法，探索了抗氧化化合物X5与自噬的关系。利用网络药理学，我们确定了X5与自噬相关蛋白之间的相互作用。随后，我们在体外评估了X5对氧化应激诱导的PC12细胞自噬的影响。此外，我们还评估了X5对MCAO后大鼠的保护作用。综上所述，本文采用网络药理学和实验验证相结合的方法探讨了抗氧化化合物X5与自噬的关系，X5可能是治疗CIRI的有前景的化合物。

结果

在之前的研究中，我们发现了一种具有优异抗氧化活性的新型化合物X5，但其对神经细胞的有效性仍有待研究。PC12细胞来源于大鼠嗜铬细胞瘤;它们表现出神经元样的特征，可以分化成类似神经元的细胞类型。本实验将PC12细胞与不同浓度的X5和姜黄素（CUR） （5 μM）孵育42 h，观察其对细胞的毒性评估PC12细胞。X5对PC12细胞几乎没有毒性作用。H2O2-induced损伤模型是体外常见的氧化应激损伤模型。PC12细胞与X5、姜黄素、TBHQ和NAC孵育18小时，然后H2O2处理24小时。随后，通过MTT法评估其抗氧化活性。H2O2损伤后的PC12细胞存活率约为51%;然而，X5和TBHQ的预孵育使细胞存活率保持在80%以上，而姜黄素和NAC对细胞没有保护作用。H2O2处理PC12细胞增加ROS和MDA水平，增加细胞毒性，促进LDH释放。然而，用X5预孵育的PC12细胞明显阻止ROS和MDA水平的增加，并以浓度依赖的方式抑制H2O2刺激后LDH的释放。因此，X5通过降低ROS、MDA和LDH的水平来保护PC12细胞免受H2O2-induced氧化应激损伤。

为了进一步研究X5与自噬的作用机制，我们将X5替换为网络药理学。我们将化合物X5的结构导入SwissTargetPrediction数据库进行预测，鉴定其潜在靶点，最终利用UniProt数据库进行校准和去权重后获得92个有效靶点。利用Disgenet数据库共鉴定出10290个与自噬相关的靶标。随后，通过组合工具VennDetail Shiny，如图3A所示，我们鉴定出了X5与自噬之间的76个共同靶标，表明X5对自噬相关通路有很大影响。将76个共同靶点导入STRING数据库，调整置信区间为0.4，隐藏断开的节点，最终得到相应的蛋白质相互作用网络（PPI）。节点表示作用的目标，线条表示目标之间的相互作用。线粗表示对数据的高支持度和高置信度。hub蛋白的发现将从STRING中得到的网络图用Cytoscape软件进行PPI网络拓扑属性分析。网络的平均度为14.83，平均间距为3.74c×10 -2。选取度和中间度均大于平均值的节点作为重点目标。结果进行视觉分析，如图4所示。节点的大小和颜色强度与目标的度值直接相关，表明字符越大、颜色越鲜艳代表的度越高。最终鉴定出枢纽蛋白mTOR、AKT1、CASP3、HIF1A和ERBB2。X5抑制自噬的机制为了研究X5抑制自噬活性的机制，我们将化合物 X5 与 mTOR、AKT1、CASP3、HIF1A、ERBB2进行了分子对接实验。化合物X5占据CASP3、ERRB2、HIF1A的激酶结构域，结合能较低，分别为-16.0、-14.8、-13.0 kcal/mol。表明其结合高度稳定。然而，X5与mTOR和AKT1的结合亲和力较差，需要额外的能量才能结合。因此，我们推测X5通过结合CASP3、ERRB2或HIF1A抑制自噬，进而抑制mTOR和AKT1的表达。GO和KEGG富集分析使用DAVID系统对78个常见靶标进行富集分析。

KEGG富集分析揭示了几种富集的信号通路，并选择了前10条（p值最小）进行进一步分析。结果揭示了PI3K-AKT信号通路、内分泌抵抗和TNF信号通路的潜在参与。GO函数注释得到298个反馈项，其中p值< 0.01的反馈项有122个。提取前10个词条进行进一步分析。我们的研究揭示了与细胞对化学应激、氧化应激、磷酸化调节和肌醇脂质介导信号传导的反应相关的丰富的生物过程（BP）。此外，富集的细胞组分（CC）与转移酶复合物、gaba受体复合物和GAB受体复合物相关。富集的分子功能（MF）也与丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白酪氨、酸激酶活性和跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性相关。