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摘要：目的：探索细胞蜡块制备技术在科学研究中的应用。方法：细胞悬液若干，置于离心机中离心（1000转/分钟）10分钟，弃上清液，沉淀物加PBS洗10分钟；同上重复离心一次，弃上清液；沉淀物加95%乙醇、中性甲醛缓冲液脱水固定10分钟。再离心，弃上清液；沉淀物加95%乙醇、中性甲醛缓冲液脱水固定10分钟，弃上清液。收集细胞，并随常规组织一起处理切片，分别进行HE染色、免疫组织化学、免疫荧光等。结果：细胞蜡块切片与常规组织切片效果基本一致，细胞量丰富，结构清晰，背景干净；在HE、免疫组织化学、免疫荧光等常规科研技术中染色颜色鲜亮、对比度好。结论：细胞蜡块制备技术，使细胞学实验不再受制于时间及空间的限制，细胞蜡块可反复切片，更加节省科研人员的时间、人力、物力及财力，值得各位同道进一步应用探索。

关键词：细胞蜡块制备技术科学研究应用

【中图分类号】 R36 【文献标识码】 B

近几年，细胞蜡块制备技术已在临床细胞病理学中逐渐推广应用，可以弥补传统涂片的不足[1-2]。由于细胞蜡块中细胞形态清晰，细胞集中，一定程度上保留了组织学的形态特点，因此在后期的特殊染色、免疫组织化学、分子病理等方面有很大的优势。由于该技术在科学研究的应用中鲜有报道，而细胞培养技术后期与临床细胞病理学有某些相似性，故我们尝试收集一定量科研样本，探索该实验技术效果。

1材料和方法

1.1材料收集湖北医药学院胚胎干细胞研究所培养的U87-MG系人脑胶质细胞瘤细胞株（DMEM+10%FBS培养基，37℃、5%CO2培养箱内培养，24h换液一次），采用0.25%胰酶消化成细胞悬液。

1.2试剂及仪器DMEM+10%FBS培养基为Gibco公司产品（批号：8121014）；实验用0.25%胰酶，为Beyotime公司产品（编号：C0201-500）；胎牛血清为HyClone公司产品（批号：FHB46531）；免疫组化鼠单克隆性抗体GFAP（编号：ZM-0118）、Ki-67（编号：ZM-0167）及SP染色试剂盒（编号：PV-9000）购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3细胞蜡块制作方法将用胰酶消化后的细胞悬液若干，置于离心机中离心（1000转/分钟）10分钟，弃上清液，沉淀物加PBS洗10分钟；同上重复离心一次，弃上清液；沉淀物加入95%乙醇及中性甲醛缓冲液（按1：1比例）脱水固定10分钟。再离心，弃上清液；沉淀物加95%乙醇、中性甲醛缓冲液脱水固定10分钟，弃上清液。用牙签轻轻拨动已呈团块的沉淀物，收集聚集成团的细胞，用干净纱布包裹放入一次性包埋盒，放入全自动脱水机随常规组织一起固定、脱水、透明、浸蜡，并行包埋、切片备用，分别进行HE染色、免疫组织化学、免疫荧光等。

1.4切片与烤片将细胞蜡块放入-20℃冰箱冷冻室中，持续冷藏放5-10 min后进行常规切片。常规粗修蜡块时不要过度修片，切片厚度为3μm，均切白片数张备用，置入80℃烤箱烤片10 min。

1.5常规HE、免疫组化及免疫荧光染色二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化后，一张切片进行常规HE染色，其余切片分别选择不同的抗体进行免疫组化、免疫荧光染色。按照一抗及二抗试剂要求，进行PowerVision二步法免疫组化染色。经过抗原高温高压修复（EDTA）、3%H2O2阻断内源性过氧化物酶、动物非免疫血清封闭、一抗37℃恒温孵育1h、加反应增强剂37℃孵育25 min、加辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物37℃孵育25 min、DAB显色等步骤后行苏木素复染，盐酸酒精分化，温水返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。按照免疫荧光试剂盒要求，依次进行脱蜡、抗原修复（同组化）、阻断、荧光淬灭、封闭、添加一抗、添加二抗、DIAP染色、封片等步骤，荧光显微镜下观察。

2结果

2.1细胞蜡块切片HE染色结果细胞数量丰富，厚薄适中，背景干净，结构轮廓清晰，颜色鲜亮，红蓝对比好，肿瘤细胞核仁明显，（见图1）；

2.2免疫组化及免疫荧光标记结果抗体GFAP在瘤细胞弥漫性表达，胞质呈棕黄色着色（见图2）；Ki-67在瘤细胞弥漫性表达，胞核呈棕黄色着色（见图3）；绿色荧光标记瘤细胞胞质显示绿色荧光（见图4）

3讨论

细胞蜡块制备技术由于可以弥补传统细胞涂片的不足，达到类似组织蜡块的理想效果，故近年在临床病理中逐步得到发展完善，甚至商品化的细胞蜡块制备管也在研发中[3]。而科研人员在进行细胞学相关的科学研究中同样会面临受制于细胞培养的时间、地点、不易保存等问题，故我们尝试将细胞蜡块制备技术应用于细胞学相关科学研究中，评价其效果。

本研究显示，应用收集的人脑胶质细胞瘤细胞制作细胞蜡块进行HE染色，细胞数量丰富，结构清晰，颜色鲜亮，红蓝对比好；免疫组化标记GFAP及Ki-67，均可观察到瘤细胞弥漫阳性胞质或胞核棕黄色着色；免疫荧光标记胞质蛋白呈阳性，制片效果与常规组织切片效果基本一致。与传统细胞学实验相比，制成细胞蜡块后再进行HE、免疫组化、免疫荧光，实验不再受制于细胞培养的时间及地点，并可以反复切片进行同样的实验，避免重复培养细胞的困扰，更加节省科研人员的时间及精力，也更经济实用，因此该法值得广为推荐。

参考文献：

1.胡沙沙，林东亮，户燕姣等.一种新型细胞蜡块制备技术应用体会[J].中华病理学杂志，2019，48（11）：890-892

2.邹尹影，尤启汉，徐黎明等.涂片回收细胞蜡块的制备技术及临床应用价值.[J].中华病理学杂志，2020，49（2）：191-194

3.丁会珍，刘丹丹，程霞等.细胞蜡块制备方法的应用进展[J].现代肿瘤医学，2021，29（7）：1259-1262

[作者简介]：刘薇（1984-），女，湖北十堰人，主管护师。

[通讯作者]：国宏莉（1979-），女，湖北宜昌人，副教授，副主任医师。