摘 要：目的：采用网络药理学及分子对接技术相结合的方法，探讨射干麻黄汤治疗咳嗽变异性哮喘的作用物质基础，为该方的临床用药和科学研究奠定基础。方法：通过TCMSP检索9个方剂的药效物质靶标；通过GeneCards，OMIM，PharmGkb，TTD，DrugBank等数据库查找与咳嗽变异型哮喘发病有关的基因；采用Cytoscape技术对药靶和致病基因进行交叉分析，建立了中药复方的调节网络；利用R语言对关键基因进行GO及KEGG富集分析；在此基础上，利用Vina进行蛋白质与配体的对接。结果：共有254个候选药靶；共获得9条关键调控因子：TNF，MAPK14，AKT1，ESR1，STAT1，MAPK1，EGFR，TP53，MAPK3；GO富集的氧化胁迫响应最显著；KEGG的富集性研究以流体剪切和动脉粥样硬化通路；分子对接发现槲皮素与TNF和AKT1基因具有较好的结合性。结论：此研究充分反映了射干麻黄汤多成分、多靶点、多通路的功效，本研究将为射干麻黄方防治哮喘的临床应用奠定基础。

关键词：网络药理学；变异性哮喘；分子对接技术；咳嗽；射干麻黄汤

基于多组分多功效的中药组合，将其与网络药理学方法有机地融合，可以针对疾病特异性的信号节点开展多靶点的药物设计，并借助计算机模拟等手段，实现多路径调控，探寻其作用机理，减少毒副作用，增强疗效。

1.资料和方法

1.1资料

数据库：中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）；全球蛋白质资源（UniProt）；基因卡片（GeneCards）；人类孟德尔遗传在线数据（OMIM）；蛋白质数据库（PDB）；药物遗传和基因库（PharmGKB）；治疗目标数据库（TTD）；有机小分子性生物数据库（PubChem）。

软件：R-4.1.1；Perl-5.30.0.1；Cytoscape_v3.8.0；ChemBio3DUltra14.0.0.117；Vina。

1.2方法

1.2.1提取药物活性成分靶点

采用TCMSP方法从中药组中分离出Shegan（射干）、Wuweizi（五味子）、Kuandonghua（款冬花）、Shengjiang（生姜）、Dazao（大枣）、Xixin（细辛）、Ziwan（紫菀）、Banxia（半夏）和Mahuang（麻黄）9个中药的药效物质基础。

1.2.2查询疾病相关基因

通过GeneCards，OMIM，PharmGkb，TTD，DrugBank等检索与咳嗽变异型哮喘发病有关的基因。在这些基因中，GeneCards449，OMIM50，PharmGkb101，在TTD及DrugBank上均未找到。通过整合三个数据库，获得3个候选基因。

1.2.3药物成分靶点与疾病基因进行交集

通过对方剂中每个靶标的ID值进行转化，得到与该疾病关联的基因文档的R语言交叉。该算法会对构成该方剂药靶的重复基因进行自动筛选。

1.2.4构建中药复方调控网络

利用cytoscape技术，建立了一种基于co-gene的中药方剂调节网络。将与该病症有关的有效成份靶标的交叉输入到Cytoscape中，可以看到的标志彼此之间的相互作用。

1.2.5构建蛋白互作网络

利用该模型建立了基于该模型的药物相互作用网络，并对其进行了初步的筛选，寻找核心基因的网路。然后，将已知的药靶与致病基因的交互信息输入到StringPPI页面中，将其评分设定为0.9，去除相互关联的基因后，再对网络进行最优，最终获得蛋白质相互作用网络。然后利用CytoNCA插入器对各个结点进行评分，选出得分最高的结点重新建立神经网络，最终获得最优的结点。

1.2.6富集分析

利用R软件对该调节网络进行GO及KEGG富集分析，绘制通路图。运用R将作用靶点进行GO和KEGG富集分析，验证水平为=0.05，P<0.05。

1.2.7分子对接

基于 PubChem数据库，采用ChemBio3D技术实现从二维到三维的转化。并利用 PyMOL软件对 PDB数据库中的靶蛋白进行三维建模，并对其进行优化。然后，利用 AutoDockTools对配体与蛋白质的结合位点进行鉴定。在此基础上，以 Vina为载体，将其与传统的药物靶标（药物靶标）、小分子（药效物质）进行对接。

2.结果

2.1获取方剂中各药物有效活性及靶点

将其作为药物的有效性（OB）≥30%、成药（DL）≥0.18的前提下，对方剂中各组分的药效物质基础及作用靶标进行系统研究。其中各药物有效活性成分：射干17个、麻黄23个、生姜5个、细辛8个、紫菀19个、款冬花22个、大枣29个、半夏13个、五味子8个。各药物靶点：射干736个、麻黄3919个、生姜2225个、细辛1667个、紫菀857个、款冬花1088个、大枣1329个、半夏1301个、五味子995个。

2.2疾病相关基因

本研究团队利用 GeneCards，OMIM，PharmGkb，TTD， DrugBank等检索出与 CVA有关的基因，通过查找发现，各数据库相关基因数目如下：GeneCards449个、OMIM50个、PharmGkb101个，TTD和DrugBank未发现本病相关基因。

2.3药物靶点与疾病相关基因

利用 R分析法，最终得到了射干麻中254个药靶。将该系统与560个致病基因进行交集分析，共获得75条交集的基因。

2.4构建中药复方调控网络

采用 Cytoscape对其进行可视化，在可视化网站的开发过程中，其中，大枣用蓝、半夏用红、紫菀用紫等方法，利用这些标志可以清晰地看出各药材的药用部位。

2.5蛋白互作网络及核心基因筛选

利用 CytoNCA插件法对各个结点进行评分，从中选出可供进一步研究的关键基因。两个评分标准为：第一次BC≥23.66，CC≥0.21，DC≥4.5，EC≥0.06；第二次BC≥10.29，CC≥0.52，DC≥6，EC≥0.15。初步确定了该调控通路的关键因子，包括 TNF、MAPK14、AKT1、ESR1、STAT1、MAPK1、EGFR、TP53、MAPK3等。

2.6GO富集分析和KEGG富集分析

在GO富集中，设置BP、CC、MF分别显示10栏的数据。无论柱状图或气泡图，目标部位都有较强的抗氧化能力。在KEGG富集中，目标物被认为是最明显的，在液体剪切和动脉硬化途径，按照这个路径画出通道图表，并找到在该网络中，以TNF、AKT等关键基因表达最为显著。

2.7分子对接

将中药有效成分的小分子配体2D结构下载并转换为3D结构，将蛋白质的靶标与水、小分子一起移除，利用生物信息学技术筛选出与射干麻黄汤方相关的小分子配体与蛋白质受体之间的最优结合位点，实现与CVA病症相关的药靶与射干麻中药效物质的分子对接。前期研究结果显示，TNF、AKT1均与槲皮素等小分子配体存在关联。经计算机模拟计算，TNF、AKT1与槲皮素的结合能分别为-8.80 kcal/mol；表明二者结合能较低，结合效率较高，结合结构稳定。

3.讨论

在本研究中，通过分析得到TNF、MAPK14、AKT1、ESR1、STAT1、MAPK1、EGFR、TP53和MAPK3共9个核心基因，它们在炎症反应和免疫反应等过程中发挥重要作用。文献报道 ，TNF激活的炎症反应主要通过与TNFR1结合，介导下游核转录因子NF-kB等通路发挥抗炎以及生物活性作用。有研究表明，通过对 TNF的调控，可以减少MMPs的平衡，从而达到对哮喘患者进行干预的目的。研究发现KEGG富集中，靶点在流体剪切力与动脉粥样硬化通路中富集明显，血管内的关键分子TNF、AKT1均显著升高，提示射干麻黄汤可能是通过调控 TNF及AKT1发挥抗 CVA效应的。

同时发现在中药复方网络调控中，TNF和AKT1都与槲皮素小分子配体相关。已有研究显示，槲皮素对轻微气喘患者有一定的防护及防治效果，可有效地降低其发病次数，并可有效地控制临床症状。已有研究表明，槲皮素可上调PON2的表达，抑制各种刺激所致的氧化损伤。PON2在肥胖型哮喘中显著下调。本研究有望为临床防治肥胖型哮喘提供新思路。也有人研究表明，槲皮素可降低炎性因子分泌，使气管环舒张。通过计算机模拟计算，发现麻黄汤中槲皮素能与 TNF、AKT1形成较强的亲和作用，并进一步证实了上述结论。

4.结论

总之，本研究通过网络药理学对射干麻黄汤治疗CVA的活性成分、核心靶点以及可能的作用机制进行研究，同时利用分子对接技术进行实验研究，证明了射干麻黄汤对 CVA的作用是多成分、多靶点、多途径特点，为今后定喘汤防治 CVA的机理研究奠定基础。

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作者简介

柯桂兰（1969.1-），女，汉族，大专，副主任中药师，研究方向：药学。