打开文本图片集

摘要：创建正相高效液相色谱法测定软胶囊中维生素K2含量，同时通过该方法的建立，为维生素K2在日常生活中的检测，以及质量控制，提供非常重要的参考，而且实用价值也相对较高。而且维生素K2有许多种类型。其中，最为常见的是日常饮食当中的肉蛋类，如K2（20），以及部分发酵豆类当中，由数量众多细菌所合成的K2（35）。维生素K2（35）也被称之为甲萘醌-7，属于是维生素K2当中，有着最广泛的功能、最强大的活性、最持久的作用，最安全且有着最昂贵的价格的一种成分。

关键词：正相高效液相色谱法;软胶囊;维生素K2含量

前言：维生素K2属于是一种脂溶性的维生素，有着叶绿醌生物活性的萘醌基团的衍生物，是人体当中必备的一种重要的维生素[1]。在动物体内具有生物活性的是维生素K2，而维生素K1 和维生素K3 都要转化为维生素K2才能起作用。维生素K2（35）的作用，主要表现在四个方面。第一，对骨质疏松症进行预防与治疗，其所生成的骨蛋白质，可以与钙一并生成骨质，并使骨密度增加，从而有效地预防骨折的发生。第二，维生素K2能够有效地对肝硬化发展成为肝癌进行预防。第三，对维生素K2缺乏性的出血症进行治疗，可以促使凝血酶原的生成，并使凝血速度加快，对正常的凝血时间进行维持[2]。第四，拥有利尿与对肝脏解毒功能进行强化的效果，并可以使得血压显著降低。基于现阶段的情况，按照该类维生素的溶解度与保留的特性，创建正相高效液相色谱法，通过研究证实，该方法可以说是一种有着简单操作，强大的实用性，以及精准且快速的检测方法。

1材料与方法

1.1仪器及试剂

SAPL26-3000高效液相色谱仪（陕西仪器仪表）：3000型紫外检测（波长范围：190-600nm;噪 声：1×10-5AU/h ;波长精度：±2nm ;漂 移：1×10-4AU/h ;重 复 性：<±0.5nm; 流 通 池：8ul;量程范围：0.01-2.56AUFS）;SB-3200D型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）;分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）;津腾13*0.45um有机相针式滤器 （广州市锦卓仪器设备有限公司）;10mL容量瓶（上海安谱科学仪器有限公司）;10～100uL移液器（德国艾本德股份公司）。维生素K2（35）标准品（CAS：27670-94-6，纯度99.8%，美国USP）;正己烷（色谱纯，Fisher美国色谱纯HPLC级H302-4）﹔异丙醇（色谱纯，Fisher 美国色谱纯 HPLC级H302-4）。

1.2色谱条件

色谱柱：流动相：正乙烷+异丙醇;柱温：25℃;流速：;测定波长：;进样量：。

1.3溶液制备

1.3.1标准贮备液

全部的操作都需要在避光的条件开展，精密的称取标准品适量，加正乙烷溶解，并定容到10毫升的棕色容量瓶当中，配制成含有1.0mg/mL该维生素的溶液。

1.3.2标准曲线溶液

分别精准地吸取标准品标准的储备液，置于10毫升的棕色容量瓶当中，使用异丙醇进行稀释，并定容到刻度，混匀，分别制成浓度为的标准品标准溶液。

1.3.3试处理样

精密地称取0.4g（精确至0.0001g）的胶囊内容物，置于10毫升的棕色容量瓶当中，在加入异丙醇超声30分钟，使用异丙醇定容到刻度，并摇匀，过的有机滤膜，将滤液注入色谱仪当中进行实验分析。

2结果与讨论

2.1测定最大吸收波长

准确吸取适量的维生素K2（35）标准的贮备液，使用异丙醇将其稀释成浓度为的溶液，在波长200到400nm范围之内开展扫描，该维生素类型在处会有最大吸收。所以，将检测的波长确定为。

2.2线性的范围

把制备得到的标准工作曲线的溶液，分别注入到液相色谱仪当中，应用上述的色谱条件实施测定。以浓度X（mg/L）作为横坐标，峰面积Y作为纵坐标，开展线性回归分析，得到该类维生素的回归方程：，;最终的结果表明：该类维生素在1.0mg/L到20.0mg/L的浓度范围之内，有着良好的线性，可以用来进行精确的定量。

2.3流动相体系与色谱柱的选择

按照该维生素的脂溶性特点与公告当中，所应用的异丙醇，实施溶解的前处理方式，为了有效地避免应用其他的有机溶剂，所产生的溶剂效应，并运用正己烷/异丙醇当做流动相。在该流动相体系之下，峰形较为理想。对比例不同的正乙烷/异丙醇流动相情况进行考察，研究发现异丙醇的占比减少，以将分离度显著改善。与此同时，对比了氨、氰基两种不同的色谱柱，研究发现氰基色谱柱的分离效果、峰形，均要比氨基色谱柱更好。在综合地考虑对称因子、保留时间与分离度的基础之上，选取正乙烷+异丙醇体系当做流动相，氰基色谱柱当做分析柱。通过专属性的实验进行验证，标准溶液、维生素K2软胶囊等样品，都达到了最佳的分离效果。

2.4方法的检出限（LOD）、定量限（LOQ）

依据GB/T27417--2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》当中，关于空白标准偏差评估方法的LOD与LOQ。操作流程如下所示：分别在10个空白的辅料当中，加入由标准品标准溶液所制成的含量是每升2毫克的样品溶液，分别注入色谱仪当中进行测定，得到了标准品的含量，计算其含量的3倍标准偏差，也就是方法的LOD，10倍的标准偏差就是方法的定量限LOQ。结果如表1所示，本方法的LOD是3.8mg/kg，LOQ是12.7mg/kg。

2.5回收率和精密度

在标准品空白辅料当中，测定加标回收率。加标的水平分别是，应用上述方法做样品处理，每一个添加水平反复地测定4次。由表2可以知道，标准品的回收率是97.6%到103.7%，RSD是0.8%到1.6%[3]。能够对定量分析的要求进行满足，表明当前所建立的方法，具有一定的可行性。

与此同时，为对该方法的中间精密度进行验证，选取市场上常用的维生素K2软胶囊当做本研究的样品，在不同时间下，由不同的实验人员根据上述要求，做样品前处理，对每个样品做6平行的测试。由表可以知道，2名实验人员检测得到的标准品的平均含量分别是155.3mg/kg、152.6mg/kg，与样品标签所标示的数值160mg/kg相互吻合;RSD分别是1.3%与0.9%。说明该方法有着良好的中间精密度。

2.6耐用性

方法的耐用性是对一个分析法的好坏做出评价的指标，为对其耐用性进行考察，在实验的时候，考察进样量与柱温两个参数。选取该软胶囊依据上述方法进行前处理，制备出的样液作为进样来准备[4]。在其他条件不变的情况下，每个参数6平行，进样量则选取9-11μL来考察;选取的柱温是24℃-26℃进行考察，结果如表4所示，在进样体积不同的情况下，所检测出的结果变异系数是0.6%;柱温不同的情况下，所检测出的结果变异系数是0.6%。表明该方法的耐用性良好。

3结论

综上，在对胶囊当中的维生素K2（35）含量进行检测的时候，按照其脂溶性的特点，创建正相高校色谱法，应用氰基色谱柱，以正己烷/异丙醇（100/0.08）作为流动相，在波长是254nm之下，有着很好的峰形。与此同时，按照胶囊内容物植物油的特性，应用异丙醇直接溶解并完成提取，做到即溶即得，以将萃取的损失降到最低。通过方法学的验证表明，该方法有着良好的专属好，极高的稳定性，准确且可靠的结果，而且前处理的流程相对简单，适合在实验室大批量的进行检测操作。

参考文献

[1]孙珊珊，公丕学，张艳侠，等.柱后还原-高效液相色谱法同时测定调制乳粉中维生素K1和维生素K2[J].色谱，2020，38（7）：6.

[2]田密，麻开香，宋小飞，等.高效液相色谱法测定维生素K胶囊中维生素K2含量不确定度评估[J].食品安全质量检测学报，2020.

[3]钱忆柔.维生素KD钙片中维生素K_2的测定研究和认证[J].现代食品，2020（16）：3.

[4]许倩倩，成雪，贾迪，等.pH对高效液相色谱法测定保健食品中维生素B_（12）含量结果的影响[J].食品安全质量检测学报，2020，11（23）：195-199.