摘要：目的 分析款冬花应用于新型冠状病毒感染肺炎（以下简称新冠肺炎）的可行性。方法 通过TCMSP和Pubchem数据库以及相关文献获取款冬花化学成分，并筛选出活性成分及作用靶点；同时通过GeneCards数据库筛选新冠肺炎相关的靶点；用Venny制作韦恩图，找出交集靶点。利用Cytoscape 3. 9. 0 软件、String数据库分析款冬花的关键靶点，用 Metascape数据库选择前20个靶点通路进行GO富集、KEGG富集。结果 款冬花活性成分为16个，款冬花与新冠肺炎交集的靶点共 87个，筛选出的核心靶点10个，GO和KEGG 富集分析显示：款冬花可作用于信号通路的多个靶点而减轻新冠肺炎的肺部炎性损伤。结论 认为款冬花应用于新冠肺炎具有可行性。

关键词：款冬花；新冠肺炎；网络药理学

新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019， COVID-19）因具有极强的传染力以及无特效治疗药物，导致其在全球大规模传播.目前疫苗的接种和推广一定程度上缓解了COVID-19大流行，但从临床治疗角度仍需要行之有效的治疗手段和抗病毒药物才能阻止这种新型病毒对人类健康造成的巨大威胁[1]。新型冠状病毒肺炎属于中医学“疫病”范畴[2]，它的病因病机符合中医“疫病”的规律，其病位主在肺部，疫毒闭肺是其核心病机[3]。新冠肺炎患者多以湿疫之邪为主，伴热、寒、痰、瘀之邪，临床表现为常发热、恶寒、无汗、身痛，咳嗽，嗜睡，面色苍白，呕吐腹泻[4-6]。中医药在防治新冠肺炎中发挥了重要作用[7]。

款冬花Farfarae Flos为菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾，始载于《神农本草经》，被列为中品。款冬花是我国常用中药材，有润肺下气、止咳化痰的功效[8]。款冬花是中医临床用于治疗肺部炎症相关疾病的高频药物，含有萜类、有机酸、黄酮、生物碱和甾体类结构多样的化学成分[9]。推测款冬花具有应用于新冠肺炎的可行性，故引入网络药理学方法进行快速分析，以便促进新冠肺炎的更好防控。

1材料与方法

1.1款冬花相关靶点筛选

利用TCMSP平台筛选，在“Herbname”项下，以“款冬花”为检索词，获取款冬花已知的化学成分，根据ADME筛选出具有良好的口服生物利用度（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18）的化合物，先采用TCMSP 数据库进行靶点预测．依据筛选出的款冬花的活性成分以及其作用的蛋白质靶点，再在PubChem中，找到成分的Canonical SMILES结构，再将其传到Swiss Target Prediction数据库中进行靶点预测，并根据已发表的文献报道补充未预测到的活性化合物的已知靶点。筛选后，在Uniport蛋白质数据库将化合物作用的蛋白质靶点进行规范。

1.2.新冠肺炎相关靶点筛选

以“COVID-19”为检索词，在GeneCards数据库中获取新冠肺炎的相关靶点，得到目前治疗新冠肺炎的相关靶点。将款冬花主要成分作用靶点库和疾病靶点库对比进行筛选，得到重复靶点作为关键靶点。用Venny并绘制韦恩图。

1.3主要成分-疾病靶点网络的建立

利用 Cytoscape 3.9.0 软件处理上述数据，用交集靶点建立款冬花-化合物-靶点-疾病图。款冬花主要化合物和作用靶点用“节点”表示，二者之间的作用关系用“边” 表示。

1.4 蛋白相互作用（PPI）网络构建与分析

String 数据库（https：//string-db.org/）是检索蛋白相互作用的数据库，不仅包括蛋白质之间的直接物理作用，而且包括间接功能相关性。将款冬花的潜在作用靶点录入 String 数据库，限定物种为人，获取 PPI 关系以此建立 PPI 网络。将上述 PPI 关系导入 Cytoscape 3.0.0软件进行可视化处理，绘制 PPI 关系图，节点大小和颜色设置用于反映度值大小，对得到的网络图进行拓扑学分析，筛选出10个关键蛋白。

1.5 靶点通路分析

为进一步了解核心靶点基因的功能和款冬花在治疗 COVID-19 中的主要作用通路，将上述筛选得到的药物与疾病相关靶点输入 metascape数据库 ，通过输入的靶基因名称列表并选定物种为“homo sapiens”，经上述数据库检索和转化操作，设定阈值 P＜0.05 ，选择count值前20个进行 GO富集和 KEGG通路富集分析，并对分析的结果进行可视化处理。

2结果

2.1款冬花相关靶点筛选

在 TCMSP中获得148个化合物，设定OB≥30，DL≥0.18，得到化合物22个，逐一对应发现6个化合物无对应靶点，采用Pubchem数据库对TCMSP未预测出靶点的6个化合物进行预测，获得2个化合物的靶点信息，在知网上查看已发表的文献报道，未获得靶点信息，故款冬花活性成分为18个（表1），对应390个靶点。

2.2 新冠肺炎靶点获取结果

从 GeneCards数据库中检索到新冠肺炎相关靶点3329个，通过制作韦恩图得到款冬花与新冠肺炎的交集靶点87个，见图1。

2.3主要成分-疾病靶点网络的建立

将款冬花与新冠肺炎的交集靶点导入，根据已上所得的数据，找到靶点所对应的药物的成分，得到款冬花-化合物-靶点-疾病图，总共包含 96 个节点（1个药物节点、7 个化合物节点、87 个靶点节点、1 个疾病节点）见图2。

2.4 蛋白相互作用（PPI）网络构建与分析

使用 String 网站对得到的潜在靶点进行分析，得到靶点之间的 PPI 网络（图 3）。度值高的节点位于图的中心位置，相应节点的形状也更大、颜色越深。通过对网络进行拓扑分析，能够得到这个网络图中的枢纽蛋白其中等级值排名前10 位的包括TNF、IL6、IL1B、JUN、CXCL8、CCL2、IL10、IFNG、VEGFA、AKT1，见表2。提示这些靶点可能在网络中起着较为关键的作用，可能是款冬花针对 COVID-19 发挥作用的关键靶点。

2.5 靶点通路分析

GO 富集分析和 KEGG 通路分析 metsscape 中 GO 功能富集分析得到 GO 条目 3203个（P＜0.05），其中包括生物过程（biological process，BP）条目 1922  个，细胞组成（cell composition，CC）条目 1235个， 分子功能（molecular function，MF）条目 46 个，分别占 60%、38%、2%。其中生物过程主要涉及脂多糖（lipopolysaccharide）、细菌源性分子（molecule of bacterial origin）和细胞对脂质的反应（cellular response to lipid）等通路；细胞组成主要涉及膜筏（membrane raft）、 细胞外基质（extracellular matrix）和受体复合体（receptor complex）等方面；分子功能主要涉及细胞因子信号转导 （Cytokine Signaling）、细胞群增殖的负调控（negative regulation of cell population proliferation）和白细胞介素信号（Signaling by Interleukins）等方面。以Count值排序，各类别前 20 的通路具体信息见图 4。KEGG 通路富集筛选得到161 条信号通路（P＜ 0.05），包括 Coronavirus disease - COVID-19、Tuberculosis 等已报道与肺炎相关的通路，同样包括 Influenza A、Hepatitis C、Hepatitis B 等与肺损伤相关的通路。其中排名前 20 的通路见图 5。

3讨论

通过对 TCMSP数据库、Pubchem 数据库以及相关文献的查询、分析得出，款冬花干预新冠肺炎的活性成分有18个，其中2个活性成分均可作用于 TNF。活性成分中度值较高的黄酮类化合物已有研究报道，槲皮素、山奈酚、与新冠肺炎推荐药的亲和力相似[10]。槲皮素、山奈酚为常见的中药化学成分，对它们的研究较早、较多，具有抗炎、抗氧化等作用[11-13]。对新冠肺炎逝者解剖结果表明，巨噬细胞渗出性炎症是重要的病理表现[14-15]，槲皮素、山奈酚是干预新冠肺炎发病过程的有效成分，而靶点为TNF的其他活性成分也是关注的重点。肿瘤坏死因子（ tumor necrosis factor，TNF） 是炎症细胞因子的重要成员，主要由活化的巨噬细胞，NK细胞及T淋巴细胞产生。可溶性TNF α受体（ sTNFR ）参与感染性休克等全身炎症过程的免疫级联反应，并可介导远隔器官的炎症激活[16]。严重的炎症状态可能是导致 COVID-19 发病率和死亡率的主要原因。肿瘤坏死因子 （TNF） 水平升高是一种关键的促炎细胞因子，已被证明与 COVID-19 死亡率增加有关[17-18]。TNF在维持细胞、组织和生物体内的稳态方面起着重要作用[19]。TNF 信号通路发挥抑制“炎症因子风暴”、抗病毒等作用，以达到治疗 COVID-19 目的[20]。TNF 阻断剂可以减少在 COVID-19 过度炎症中重要的其他促炎细胞因子[21]。TNF-α 主要由单核-巨噬细胞活化产生，是机体炎症与免疫的重要调节因子。TNF-α 发挥诱导细胞凋亡、调节机体免疫应答、调控肿瘤组织血管系统、诱导细胞程序性坏死等方面的功能[22]。TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10 和 HMGB1 水平越高，肺炎病情越严重[23-24]。选取50例进展期的新冠肺炎患者病例进行研究发现IL-2R、IL-6、TNF-α 在老年新冠肺炎患者，尤其在危重型患者发病机制中可能起重要作用，可以作为评估病情和协助诊疗的辅助性检验指标[25]。核心靶点的GO功能富集分析印证了款冬花通过信号转导等生物过程干预新冠肺炎．通过对KEGG通路分析，款冬花可作用于TNF信号通路的靶点，认为款冬花可能通过TNF信号通路减轻新冠肺炎的肺部炎性损伤。

综上所述，本文采用网络药理学的策略对款冬花中的活性成分、作用靶点及通路进行了快速分析，表明款冬花应用于新冠肺炎具有一定的可行性，揭示款冬花通过多成分、多靶点、多途径作用于新冠肺炎，主要的作用通路为TNF信号通路。

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