摘  要：常规的菌量测定采用平板法对菌落的形成单元进行统计。ATP生物发光技术为微生物的快速计数奠定了新的操作基础。因为它的整个工艺流程只需半小时或数分钟，并且具有很高的检测敏感性，因此，在食品、饮品生产中，能够实时监控原材料和制品的品质，特别是需要进行微生物快速的检测的同时，还对某些不易进行培养的细菌及不适合进行计数的样本进行分析，此外，ATP生物发光技术可以填补平板培养基的缺陷。本文将简要阐述 ATP生物发光技术的若干基本问题及其在我国的实际运用。

关键词：ATP生物发光法；微生物；快速检测

引言：腺嘌岭核苷三磷酸作为载体检测的快速、灵敏、简便等优点已在食品、医疗和废水处理等方面得到了广泛的肯定。例如，在食品工业中消毒和奶类产品中的微生物数量测定；医用器械消毒，药品成品检验，医院内部环境空气污染评估；而废水治理方面， ATP可以反映出微生物活性、代谢水平以及污水处理厂的工作状况，当微生物对污染物进行降解时，其细胞中 ATP浓度与其处理效率呈直线相关。ATP是一种重要的生物，它可以为人体的所有细胞供给必需的能源。研究表明，不同的生物组织中 ATP的水平大致一致，通常是5x10～16-5x10～15 g，所以在使用时可以根据 ATP的浓度来判定细菌的数目。现有的 ATP测定技术主要有色谱法、电泳法和光学法。在这些方法中， ATP生物发光法因具有快速、简便、灵敏度高等特点，已成为微生物检测领域的热点。

1.ATP生物发光法原理及检测步骤

ATP的生物发光机理是：在氧气条件下，荧光素酶和Mg2*与 ATP发生化学反应，产生荧光素-AMP复合物，并能产生一种焦磷酸酯；在O2的催化下，磷酸- AMP复合物产生了大量的氧化性磷酸盐，并产生CO2，H2O和 AMP；最后，被激发的磷酸盐回到了基础状态，释放了可以转换对等量为ATP的光子。ATP生物发光技术的测试过程，主要分为提取 ATP、加入荧光素-荧光素的反应、生物发光度的测定3个环节，利用 ATP生物发光方法的标准线进行分析，从而得到样本中的微生物数量[1]。

2.酶反应体系

用两种亚基组成二聚物形成的萤光素，不同的荧光素的发光波长略有差异，其发光的波长在552～582纳米（562纳米）之间。现有的商业用萤光素酶经硫酸铵沉淀、离子交换、凝胶过滤、亲和色谱等多种方法从萤光虫体中分离得到，通常可以达到1 pgATP的水平。1985年 Jeffrey等对萤光素基因序列进行了分析，并克隆出了萤光素基因，并在 ELISA （E. Coli）上进行了基因的有效表达。用基因工程制备的萤光素，能够改善其稳定性及活力，并能抑制萤光熄灭。并可以实现发光光谱的蓝色偏移量，提高测量效率。这对于生产具有特异性，高活性，低成本的商用萤光素酶酶谱及限制其测定敏感性的研究具有十分重大的现实价值。

3.微生物数量的检测方法及其他影响因素

3.1检测方法

目前，世界上已有许多不同的微生物测定方法，例如用常规的平板式细菌计数法，一般要在37° C温度下24～48小时才能得到，而用4～7天来测定酵母和霉菌等。因此，常规的微生物检测方法不仅繁琐而且耗时较多，并且很难满足不同工业对微生物的快速测定要求；其它的方法如：血球计数法、膜过滤计数法等，操作简单，结果准确，但在较大范围内形成如污泥、沉积物等，难以用于测定细菌的数目；应用荧光原位杂交-流式细胞仪和高光谱成像技术可以快速、准确地测定，但是操作繁琐且容易受测量环境的限制。目前，微生物的定量检测技术正逐步走向高技术、智能的发展，其共同特点是快速、简单、准确。与传统测定方法相比， ATP的生物发光技术具有无需培养、操作简单、快速等优点，同时，实验的数据和总细菌数量有密切关系，能迅速完成微生物的数目检测。在食品卫生、医药、生态环境科学等各方面都得到了广泛的运用[2]。

3.2其他因素

基于ATP生物发光的化学分析，因灭菌剂残留、样品性质、萃取剂颜色及试验设备不同，这些都会对 ATP的荧光测定有一定的干扰。在医学和其它环境洁净程度的探讨中， ATP生物发光技术容易被细菌的残留量所干扰，导致产生伪正或伪负。在对洁净度进行评估时，发现其物质的物理性质对 ATP的累积也有一定的作用；在 ICU消毒后，对周围表层进行检测，结果表明，各种仪器测量的 ATP存在很大的差异。另外，提取剂的色泽也会影响 ATP的测定。实验发现，加入柠檬黄的对照组和试验组（不加入柠檬黄）有较大的差异，并且随着颜料浓度的增加，其对光子的杀伤效果也会增强。综上，ATP生物发光技术在测定微生物 ATP水平时，受多种因素的制约，这些结果为进一步精确测定土壤中 ATP的浓度和质量奠定了基础。在具体的使用中，要根据行业特点和测试需求，采取相应的测试方法，以对各领域 ATP能够进行高效的检测。

4.ATP生物发光及检测的应用

ATP生物发光技术在近几年得到了广泛的使用和发展。在食品方面，ATP非常适用于食品生产过程中的危险分析及关键环节的微生物检测，普遍用于食品生产线，食品设备的清洗，乳制品，蔬菜和调味品的杀菌；在医疗方面，该技术模型可应用于医用设备消毒效果评价、医疗室环境清洁评价、药物敏感性试验评价[3]；ATP荧光检测器是根据萤火的发光机理，采用“荧光素-磷素”对 ATP进行快速的测定。我国 ATP检测器的研发起步较迟，但由于技术水平的日益提升，对 ATP的要求越来越高， ATP的测试技术也日趋完善，相关的 ATP测试设备也逐步更进，并且有了便携 ATP的测试设备。现在市面上已经出现了很多便携式 ATP型的荧光检测器，它们可以迅速地进行测试（一般仅需5～20秒），并且操作方便。相关应用已经在食品，医药，医药，日化，造纸，工业水处理，国防，环保，水政，海关，海关和其它执法机构得到普遍推广。

结语：目前，ATP生物发光法已在食品、医疗、卫生消毒及环境科学等领域中微生物的检测方面获得了广泛发展与应用，在食品安全、医疗消毒与废水处理效果评价方面日益发挥重要作用，而在未来，随着时代科技进步，ATP生物发光技术将得到更为时代化的革新，从而紧跟发展推陈出新。

参考文献：

[1]董曼曼，卫星华，孙晓，王涛，贺立，张亚锋.手持式ATP荧光检测仪性能评价[].食品安全质量检测学报，2018，9（11）： 2627-2630.

[2]龚大江，刘家家，李春斌，彭年才，李明，张镇西.手持式ATP荧光检测仪的研制[C].中国生物医学工程进展：2007中国生物医学工程联合学术年会论文集（上册），2007：360-363.

[3]周爱玉，罗金平，岳伟伟，何保山，杨庆德，蔡新霞.手持式ATP生物荧光检测仪研制[J].传感技术学报，2008，21（4）： 543-546.