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摘要：通过数据库筛选六君子汤加减中药物活性成分、靶点及肿瘤相关性厌食靶点基因，构建相关作用网络并进行基因富集注释，初步分析六君子汤加减对肿瘤相关性厌食的分子作用机制。

关键词：六君子汤；肿瘤相关性厌食；网络药理学

1.资料与方法

1.1筛选六君子汤加减（红参、白术、茯苓、木香、陈皮、砂仁、半夏、甘草）活性成分、靶点

通过TCMSP数据库，检索红参、白术、茯苓、木香、陈皮、砂仁、半夏、甘草的活性成分和靶点，设置筛选条件为生物利用度（OB）≥30%，同时类药性（DL）≥0.18。然后通过Uniprot数据库将物种限定为人，最后进行校正各个靶点对应的基因并获得标准化的名称简写。

1.2肿瘤相关性厌食靶点的筛选

以“Tumor-Associated Anorexia”为关键词，在OMIM、PharmGkb、DrugBank、GeneCards等相关数据库进行检索，除去假阳性和重复的靶点，最终取并集后得到疾病靶点基因的数据集合。

1.3对肿瘤相关性厌食作用靶点的预测

用Venn R将六君子汤加减与肿瘤相关性厌食基因共同靶点进行对比分析，用Venn图展现出药物和疾病的交集靶点，并构建六君子汤加减的调控网络（以交集靶点作为桥梁）。

1.4六君子汤加减调控网络的构建（活性成分与靶点）

将六君子汤加减活性成分、肿瘤相关性厌食靶点基因及交集靶点基因信息导入Cytoscape 3.7.1软件，构建并绘制关于六君子汤加减活性成分与靶点的调控网络，展示肿瘤相关性厌食疾病基因与六君子汤加减活性成分的相关性大小。

1.5构建肿瘤相关性厌食基因与六君子汤加减共同靶点的蛋白质互作网络（PPI）

先将“六君子汤加减对肿瘤相关性厌食作用靶点的预测”中得到的交集靶点导入String数据库，然后建立PPI网络。再将获得的信息导入Cytoscape 3.7.1软件中（以tsv形式），最后进行精简分析（根据度值），构建PPI核心网络。

1.6基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析与京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）

KEGG通路分析将基因简写转化为基因ID，再运用R软件对“药物－疾病”基因进行GO富集和KEGG通路富集分析。

2.结果

2.1六君子汤加减中活性成分以及靶点筛选结果

通过TCMSP数据库筛选得到六君子汤加减中相关药物成分，再根据OB和DL参数进行筛选，然后继续在TCMSP中检索药物相关靶点，将所得到的结果在UniProt数据库中匹配校正并去除重复靶点，获得活性成分和潜在靶点。

2.2肿瘤相关性厌食基因的筛选

首先，我们利用“Tumor-Associated Anorexia”这一关键词，在OMIM等四个数据库中进行了详尽的搜索。紧接着，在GeneCards数据库中，进一步筛选Relevance score＞1.0的基因，并对从五个数据库中检索到的基因进行了去重复和取并集的处理，最终筛选出了2223个与肿瘤相关性厌食密切相关的基因靶点。为了更直观地展示这些基因之间的关系和重叠情况，我们绘制了Venn图，见图1。

2.3“及六君子汤加减药物靶点-瘤相关性厌食疾病基因”交集作用靶点的预测

通过R 4.3.0进行Venn分析肿瘤相关性厌食疾病基因靶点及六君子汤加减有效活性成分对应的基因靶点，获得直接或间接的显效靶点基因交集103个，见图2，包括PTGS2、PGR、ACHE、OPRM1、DPP4、PTGS1、HSP90AA1、PRSS1、AKT1、VEGFA等靶点。

2.4“活性成分-靶点基因”调控网络的构建

构建“六君子汤加减－肿瘤相关性厌食疾病靶点”网络图（通过Cytoscape3.7.1软件构建），见图3。度值越大，其在调控网络中的作用越大。由网络图可见获得的网络由113个活性成分和103个潜在靶点基因组成，其中蓝色代表潜在靶点基因，其它颜色代表六君子汤加减中活性成分。113个活性成分与潜在靶点基因相互作用，这说明六君子汤加减是通过多成分、多靶点、多途径来干预肿瘤相关性厌食的。

2.5交集靶点（六君子汤加减与肿瘤相关性厌食）PPI网络的构建

将分析后的103个交集基因导入String数据库，物种设置为 Homo sapiens，并设置medium confidence为0.95，去除游离节点，得到药物疾病（六君子汤加减与肿瘤相关性厌食）交集靶点的蛋白互作网络图，见图4。将所获取的网络图以tsv的形式导入Cytoscape 3.7.1软件中，利用CytoNCA对节点进行Betweenness centralities、Closeness central ityes、Degree centralities、Eigenvector centralities、Local average connectivity-based centralities、Network centralities数值计算两次，选择数值大于中位值的节点构建PPI核心图，见图5。最终的核心PPI排列如下：MYC、TP53、STAT3，这些核心靶点被认为发挥着主要作用。

2.6 GO富集注释

对六君子汤加减干预肿瘤相关性厌食的核心靶点基因进行GO富集分析并绘制气泡图，横坐标为基因比例，纵坐标为富集在每个GO上的基因数目，为了更直观地展示富集结果的显著性，我们使用了-log10转换后的值来表示，并将其映射为不同的颜色。这样，颜色越深，就表示该GO类别的富集结果越显著。同时，气泡的大小也反映了该GO类别中基因的计数值，气泡越大，表示该GO类别中的基因数量越多。见图6。

生物过程（BP）的富集结果提示交集基因主要参与对辐射的反应、上皮细胞增殖、对外源性刺激的反应等生物反应。

细胞定位（CC）的富集结果提示交集基因主要分布在膜筏、微膜结构域、囊泡腔等细胞部位。

分子功能（MF）的富集结果提示交集基因主要通过与DNA-结合转录因子、受体配体活性、细胞因子活性等发挥其作用。

体现了六君子汤加减干预肿瘤相关性厌食可能是通过调控多个GO功能实现的。

2.7KEGG通路富集分析

设置具有统计学意义（P＜0.05，不符合则用q值校正）得到前30条信号通路，制作气泡图以可视化分析。气泡大小代表富集的基因个数；气泡颜色代表－log10值，见图7。图中提示主要涉及的信号通路有P13K-AKT信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等。体现了六君子汤加减可能通过多通路协同作用于肿瘤相关性厌食。

3.讨论

肿瘤相关性厌食是指恶性瘤患者进行性消瘦的综合征，临床上常出现厌食、体重下降等症状，文献报道肿瘤患者中厌食的发病率为40%～80%[1]。肿瘤患者厌食会导致自身体质量下降，免疫力降低，也会增加恶液质风险以及出现心理问题，从而影响患者的生活质量和生存时间，在临床上我们可以采用中西医综合治疗来改善患者食欲，尽可能提高患者生活质量。西医治疗方式虽有一定的疗效，但不能忽视带来的副作用，中医药因具有副作用小且亦有疗效而值得深入研究。六君子汤（ Liujunzi Decoction，LJZD ）是中医经典补益方剂，对多种厌食症有较好的防治作用。有证据表明，LJZD能够改善肿瘤相关性厌食症[2-5]。本研究基于网络药理学方法对六君子汤加减干预肿瘤相关性厌食的作用机制进行分析、阐述，以期为临床应用六君子汤加减治疗肿瘤相关性厌食症提供相关理论依据，为进一步研究奠定基础。

根据“活性成分-靶点基因”网络图可见，六君子汤加减中甘草相关活性成分最多，六君子汤加减中起作用的主要活性成分包括槲皮素（Quercetin）、甘草查耳酮A（licochalcone a）、黄芩素 （baicalein） 等，其中槲皮素是一种天然黄酮类化合物，它具很抗病毒、抗癌、抗氧化等多种作用[6]。甘草查耳酮是一种雌激素黄酮，甘草查耳酮A具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用[7]。黄芩素具有抗氧化应激、抗炎与调控细胞凋亡等药理学功能，在肿瘤研究中可作为重要的辅助治疗药物[8]。除上述活性成分外，分析得到等豆甾醇（Stigmasterol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、芒丙花素（formononetin）等物质可能也是六君子汤加减干预肿瘤相关性厌食的有效成分，在改善肿瘤相关性厌食方面可能也能起到一定的作用。目前，以上有效成分与肿瘤相关性厌食相关研究数较少，有些作用机制尚不明确，值得深入研究。

通过PPI核心图得到3个与肿瘤相关性厌食关系最为密切的靶点基因：MYC、TP53、STAT3。此外，本研究分析中提示CDK2、CDK4、MAPK1等基因与肿瘤相关性厌食也较密切，有待更深入的研究明确其作用机理，为治疗肿瘤相关性厌食提供新思路；基于KEGG通路富集分析发现，六君子汤加减干预肿瘤相关性厌食的潜在作用机制可能包括P13K-AKT信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等，这些通路需待相关实验、研究去进一步验证；本研究基于网络药理学，将生物信息学技术与传统中医药相结合，筛选并分析六君子汤加减的有效活性成分及靶点，疾病的靶点基因。利用数据库和文献资料，运用相关软件分析与构建作用网络及通路。

综上，六君子汤加减可能是通过多成分、多靶点及多通路的协同作用干预肿瘤相关性厌食，这为其进一步深入研究提供了一定的思路及理论依据。

参考文献

[1]宋丹.肿瘤相关性厌食的证型相关因素分析与用药规律[D].辽宁中医药大学，2022.

[2]Yoshiya T， Mimae T， Ito M， et al. Prospective， randomized， cross-over pilot study of the effects of Rikkunshito， a Japanese traditional herbal medicine， on anorexia and plasma-acylated ghrelin levels in lung cancer patients undergoing cisplatin-based chemotherapy.Invest New Drugs. 2020;38（2）：485-492.

[3]Takeda H， Sadakane C， Hattori T， et al. Rikkunshito， an herbal medicine， suppresses cisplatin-induced anorexia in rats via 5-HT2 receptor antagonism.Gastroenterology. 2008;134（7）：2004-2013.

[4]Yamada C， Hattori T， Ohnishi S， et al. Ghrelin Enhancer， the Latest Evidence of Rikkunshito.Front Nutr. 2021;8：761631.

[5]Kang HJ， Jeong MK， Park SJ， Jun HJ， Yoo HS. Efficacy and safety of Yukgunja-Tang for treating anorexia in patients with cancer： the protocol for a pilot， randomized， controlled trial.Medicine. 2019;98（40）：e16950.

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[7]高雪岩， 王文全， 魏胜利， 等. 甘草及其活性成分的药理活性研究进展[J]. 中国中药杂志， 2009， 34 （21）： 2695-2700.

[8]黄文涛，黄敏毅，张雨豪.黄芩素药理特征及缓解污染物毒性效应的作用[J/OL].生态学杂志：1-11[2024-02-29]