【作者简介】

张博阳（1990.10），女，蒙古族，河北张家口人，博士，讲师，从事景观生态修复、风景园林规划设计研究

【基金项目】：2019年张家口市级科技计划财政资助项目应用基础研究专项：雪被厚度对张家口山地森林生态系统凋落物分解及土壤微生物群落的影响研究

（项目编号：1911037A），项目负责人：张博阳

电话：15830392896

【摘要】利用 Illumina Miseq 高通量测序技术，对张家口山地森林土壤细菌进行研究，利用 FLASH 等软件对数据进行分析。分析样品土壤的优势菌群，为张家口地区森林土壤微生物多样性分析提供数据参考，对区域土壤生态学研究具有重要的理论和实践意义。

关键词：测序、森林土壤、细菌

微生物群落是陆地生态系统生物地球化学循环过程中的重要参与者，作为森林地表生态过程中极其重要和不可替代的关键组成，影响着凋落物分解过程，控制着凋落物分解速率，直接参与森林生态系统中凋落物分解的不同阶段及一系列重要生态化学过程。16S rRNA位于原核细胞核糖体小亚基上，包括 10 个保守区域（Conserved Regions）和 9 个高变区域（Hypervariable Regions）， 其中保守区在细菌间差异不大，高变区具有属或种的特异性，随亲缘关系不同而有一定的差异。因此，16S rDNA可以作为揭示生物物种的特征核酸序列， 被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标。16S rDNA扩增子测序（16S rDNA Amplicon Sequencing），通常是选择某个或某几个变异区域，利用保守区设计通用引物进行PCR扩增，然后对高变区进行测序分析和菌种鉴定，16S rDNA扩增子测序技术已成为研究环境样本中微生物群落组成结构的重要手段[1，2，3]。本研究旨在通过测序技术，分析张家口山地森林土壤细菌的多样性，为张家口地区森林土壤微生物多样性分析提供数据参考。

1材料与方法

1.1样品采集

样品采集自河北省张家口市崇礼区海拔1300米山地土壤。

1.2基因组DNA的提取和PCR扩增

采用 SDS—CTAB法对山地土壤样本的基因组 DNA 进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样本DNA于离心管中，使用无菌水稀释样本至1ng/μl。

以稀释后的基因组 DNA 为模板，根据测序区域的选择，使用带 Barcode 的特异引物，New England Biolabs 公司的 Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。

1.3 PCR产物的混样和纯化

PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测;对检测合格的PCR产物进行磁珠纯化，采用酶标定量，根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。

1.4 文库构建和上机测序

使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。

1.5测序结果分析

根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH（V1.2.7， http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/）对每个样本的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始Tags数据（Raw Tags）;拼接得到的Raw Tags，需要经过严格的过滤处理得到高质量的Tags数据（Clean Tags）。参照Qiime（V1.9.1，http：//qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html）的Tags质量控制流程，进行如下操作：a）Tags截取：将Raw Tags从连续低质量值（默认质量阈值为<=19）碱基数达到设定长度（默认长度值为3）的第一个低质量碱基位点截断;b）Tags长度过滤：Tags经过截取后得到的Tags数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75%的Tags。 经过以上处理后得到的Tags需要进行去除嵌合体序列的处理，Tags序列通过（https：//github.com/torognes/vsearch/）与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据（Effective Tags）。对所有样本的Effective Tags，以97%的一致性（Identity）进行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类，然后对OTUs的序列进行物种注释。根据物种注释结果，选取在各分类水平门、纲、目、科、属（Phylum、 Class、 Order、 Family、 Genus）上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，统计样本在不同分类水平上，相对丰度较高的物种及其比例。

2结果与分析

结果样品共得到有效序列83 679条，通过过滤低质量和短长度后的序列，共得到序列83 353条。过滤嵌合体后，最终用于后续分析的Tags序列65 860条。稀释曲线可直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样本中物种的丰富程度，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量渐进合理，更多的数据量只会产生少量新的物种（OTUs）。等级聚类曲线是将样本中的OTUs按相对丰度（或者包含的序列数目）由大到小排序得到对应的排序编号，再以OTUs的排序编号为横坐标，OTUs中的相对丰度（也可用该等级OTU中序列数的相对百分含量）为纵坐标，将这些点用折线连接，即绘制得到Rank Abundance曲线，它可直观的反映样本中物种的丰富度和均匀度。在水平方向上，物种的丰富度由曲线的宽度来反映，物种的丰富度越高，曲线在横轴上的跨度越大;在垂直方向上，曲线的平滑程度，反映了样本中物种的均匀程度，曲线越平缓，物种分布越均匀。

分析样品土壤的优势菌群，在门水平上Firmicutes（拟杆菌门）和Proteobacteria（变形杆菌门）居于前两位，分别占到了21%和20%，在纲的水平上居于前两位的是Bacteroidia（拟杆菌纲）和Clostridia（梭菌纲），分别占到了20%和12%，在目水平上Flavobacteriales和Burkholderiales（伯克氏菌目）均占到了8%，在科的水平上Weeksellaceae（威克斯氏菌科）和Lachnospiraceae（毛螺菌科），分别占9%和7%，在属的水平上主要是Bergeyella、Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Bacteroides、Dubosiella、Alistipes、Turicibacter、Sphingomonas（鞘脂单胞菌属）、Phaeodactylibacter，无法确定的属占75%。

3讨论与结论

土壤微生物群落作为森林地表生态过程中极其重要的关键组成，影响着凋落物分解过程，控制着凋落物分解速率，直接参与森林生态系统中凋落物分解的不同阶段及一系列重要生态化学过程。对土壤细菌群落多样性分析发现，在属的水平上居前位的几类，如鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）是一类丰富的新型微生物资源，可用于芳香化合物的生物降解，在农业中也有广泛应用，其对一些农药的降

解有良好效果。本研究分析张家口山地森林土壤细菌的多样性，为张家口地区森林土壤微生物多样性分析提供数据参考，对区域土壤生态学研究具有重要的理论和实践意义。

参考文献：

[1] Caporaso， J. Gregory， et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences 108.Supplement 1 （2011）： 4516-4522.

[2] Youssef， Noha， et al. Comparison of species richness estimates obtained using nearly complete fragments and simulated pyrosequencing-generated fragments in 16S rRNA gene-based environmental surveys. Applied and environmental microbiology 75.16 （2009）： 5227-5236.

[3] Hess， Matthias， et al. Metagenomic discovery of biomass-degrading genes and genomes from cow rumen. Science 331.6016 （2011）： 463-467.