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摘要：文章介绍一款快速多功能TAIL-PCR基因扩增仪的设计和工作原理。简要说明了TAIL-PCR基因扩增机理和多温点样品反应槽的结构特点和温度控制方案，同时分析高效Peltier TE致冷模块的技术特性和致冷方式。详细叙述一种智能化温控模块（含芯片TC4420/TLC2543/AT89C2051）的结构组成、技术参数和设计路线及其软硬件设计原理和温控模块与主机的通讯和温度控制的源程序。文章也提及了仪器所用的模糊PID温度控制及模糊规则表和隶属度函数等。

关键词：TAIL-PCR，基因扩增仪，Peltier，智能化温控模块，模糊PID控制

Abstract：The paper introduces the principle of multi-usage Tail-PCR instrument ， which included  an intelligent module used for adjusting temperature rapidly ，as well as analyzed the characteristic of the Peltier Element and its cooling principle. Especially， it explants detailly the  technics datasheet of the chip TC4420M＼TLC 2543 ＼89C2051 which are the core of the  module designed for control temperature. What’s more ，it provides the Program source code for communication and temperature control. Of the text， the rule function of fuzzy PID has been concerned.

Key words：TAIL-PCR，PCR instrument，Peltier，intelligent module，fuzzy PID control

一 .引言

1953年2月，沃森（Watson）和克里克（Crick）根据分子间结合能的分析计算，发现并断定了DNA是以磷酸根为外侧，以两条多核苷酸链为骨架的双螺旋结构，科学界掀起了DNA和遗传基因研究的热潮。人们对DNA双螺旋结构的分子组成和结构开展了全方位的研究。从此，生物和医学的研究进入了分子生物学这一辉煌阶段。科学家们开始对孟德尔的生物遗传三大定律在分子水平上进行各种验证和解释，建立了遗传因子即基因（Gene ）这一重要概念。提出并证实了染色体上的双螺旋结构DNA的片段，具有生物性状及遗传的特定信息。然而，从生物组织或细胞中获取的DNA含量非常低，用电泳分离后的条带也非常弱甚至一点儿也看不见。所以，必须寻求一种有效方法，能够把含量极低的目的DNA片段进行复制放大才能进行后续的大规模的DNA信息分析研究。这种能够把微弱的DNA分子在生物体外复制和放大的方法或过程，就是我们今天所说的DNA扩增或基因扩增。PCR 基因扩增[3]技术就是目前应用最广的最有效的基因扩增技术。“PCR”是 Polymerase Chain Reaction 取其中三个英文单词的首字母大写构成的，表示“聚合酶链式反应”方法。这项技术发明的诞生，大大加快了分子生物学的研究进程，其发明者也获得了1992年诺贝尔化学奖。PCR 基因扩增是要对双螺旋DNA分子在生物体外进行一系列精确可控的温度和时间的化学反应，实现DNA的体外复制。根据不同的目的DNA ，可以设置和制定不同反应温度和时间循环程序，PCR基因扩增仪就是一台可实现完成基因体外复制或扩增的自动化实验仪器。TAIL-PCR 基因扩增仪，是一台可以自动完成特殊功能的多功能PCR基因扩增仪。

二． PCR基因扩增仪结构和组成框图（参考图如下）

如附图1 所示，PCR基因扩增仪由样品反应槽（也称金属加热致冷模块）、Peltier（帕尔贴）组件、智能温控模块（自带微处理器）、控温执行模块（PID电流和方向控制器）、温度传感器组件、主机控制系统（包括键盘、显示器和通讯接口）以及稳压直流电源系统组成。样品反应槽是由良性导热金属材料加工而成的多排孔结构（12x8），可容纳 96个0.2ml的EP样品管。Peltier组件是紧紧固定在反应槽底部的加热致冷元件，是基因扩增仪的核心部件之一，其工作原理见下文详述。温度传感器组件镶嵌在反应槽里的左、中、右和底部散热器中的半导体热敏元件；智能温控模块是由8位单片机89C2051和多路串行模数转换器TLC2543M以及H桥式大电流驱动模块TC4420M构成的独立智能化温度控制模块单元，内置模糊PID控制算法程序，根据外部反馈回的实际温度变化曲线，自动优化模糊规则表，修正隶属度函数以便更快地实现温度的精确控制。主控MPU负责用户界面功能和数据的储存调取、Tm计算、程序断电保护以及外部的通讯和远程网络服务，包括故障自动诊断功能。

三．PCR 扩增的基本原理和基因扩增仪的硬软件技术分析

1.PCR技术即DNA扩增反应的一般条件步骤：

①将双螺旋DNA在高温（94°C左右）环境下变性解链成两条单链结构；

②预先设计好的目的DNA的引物在合适的低温下与单练模板碱基配对结合成假双链；

③在DNA聚合酶的作用下引物与dNTP[3]（扩增所需的4种反应原料）结合，形成DNA链；

④ 重复以上循环步骤返回到第一步，根据要求设置30多次循环，完成整个DNA扩增序。

⑤ 反应的产物若来不及处理和分析，一般需要设置9°C以下作低温保存。

2.Peltier [5]致冷模块的特性和生降温工作原理

Peltier致冷元件由大功率方柱形半导体材料按P型和N型交替间隔相串而成的半导体器件，参见图3和 图4，“NP”和“PN”接面分别焊接在上下不同的方向且相互绝缘的金属导体上。当“NP”接面连接直流电源的正极（红色导线端），“PN”接面连接电源的负极（黑色导线端）时，由于N型半导体材料中的自由电子快速向电源正极流动，P型半导体材料中的多余空穴往浮点极这边流动，因此上层的“NP”接面都从电源的两级带走了大量的电能，一个电荷带走的电能为Eq，E为所接直流电源的电动势。这样上层“NP”接面的电子带走的大量能量都在下层的“PN”接面出、处与正电荷相“中和”，增加了该接面的内能，造成了该面的温度升高；相反，由于上层“NP”接面带走了能量，因此内能减少，温度降低。这样按这个方向连接电源后，就导致Peltier元件上边致冷，下边发热。同理，如果改变加在Peltier元件两端的电源方向时，上层的接面就会发热，下层的接面就会致冷。这就是Peltier元件的致冷原理。由于Peltier元件结构简单，致冷速度快，调温控制方便，重量轻、节能环保等诸多特点，广泛应用在军事、医疗、生物等精密控温设备上。我们设计的TAIL-PCR 基因扩增仪的样品反应槽里就采用Peltier元件进行升降温控制循环的。通常，将若干只Peltier元件串联或并联起来使用 以加强致冷效果和升降温速度。

3.智能温控模块的工作原理

该智能温控模块采用了“智能化串行数据采集模块”[4]作为智能温度传感器（由11路模拟输入串行输出快速AD转换器TLC2543 和89C2051单片机）和两个半桥式驱动集成芯片TC4420M构成。两个TC4420M 构成一个大电流全桥可换向驱动电路，如图6所示，单片机2051的P1.4（16脚）和P1.6 （18脚）分别接在H/C和PWM 端，控制冷热切换（P1.4高电平加热，低电平致冷）和模糊PID算出的PWM 偏移量。各芯片的功能管脚及连接如图5所示。TLC2543L 采用SPI串行接口总线，是三线同步接口，分别为输入信号、输出信号和同步信号。另外芯片还有一根片选线，单片机通过片选线选通TLC2543L。如图5所示，CLOCK为同步时钟脉冲，CS为片选线，EOC为转换完成输出控制信号，DATAIN为单片机的数据输出和TLC2543L的数据输入线，DATAOUT为单片机的数据输入线和TLC2543L的数据输出线。

图6为TLC2543L时序图。TLC2543L 是全双工的，即数据的发送和接收可同时进行。如果只是对TLC2543L写数据，单片机可以丢弃同时读入的数据；反之，如果只读数据，可以在命令字节后，写入任意数据。数据传送以字节为单位，并采用高位在前的格式。TLC2543L 12位串行A/D转换器，使用开关电容逐次逼近法完成A/D转换过程。串行输入结构，能够大大节省51系列单片机I/O资源，且价格非常便宜，特点如下：

（1） 11个模拟输入通道；

（2） 转换时间10 s；

（3） 12位分辨率A/D转换器；

（4） 3路内置自测试方式；

（5） 采样率为66kbps；

（6） 线性误差+1LSB（max）

（7） 有转换结束（EOC）输出；

（8） 具有单、双极性输出；

（9） 可编程的MSB或LSB前导；

（10）可编程的输出数据长度。图5中

AIN0～AIN10为模拟输入端； DATAIN 为

串行数据输入端用作通道地址选择；

DATAOUT为A/D转换结果的三态串行输出

端；EOC为转换结束端；CLOCK为I/O

时钟；REF+为正基准电压端；REF-为

负基准电压端；VCC为电源；GND为地。单片机AT89C2051是整个系统的核心，给出模糊PID的PWM 信号TLC2543L对输入的模拟信号进行采集，转换结果由单片机通过P3.5（9脚）接收，AD芯片的通道选择和方式数据通过P3.4（8脚）输入到其内部的一个8位地址和控制寄存器，单片机采集的数据通过串口（3、2脚）经MAX232C转换成RS232电平向上级主控MPU传送。

4.智能温控模块的机软件设计

智能温控模块程序主要包括串行数据采集/传输模块的系统信息、通道数、采集周期和通讯协议定义，以及数据采集和传输以及PID温度模糊控制[1]子程序。

①TLC2543L的通道选择和方式数据为8位，其功能为：D7、D6、D5和D4用来选择要求转换的通道，D7D6D5D4=0000时选择0通道，D7D6D5D4=0001时选择1通道，依次类推；D3和D2用来选择输出数据长度，本程序选择输出数据长度为12位，即D3D2=00或D3D2=10；D1，D0选择输入数据的导前位，D1D0=00选择高位导前。

②TLC2543L在每次I/O周期读取的数据都是上次转换的结果，当前的转换结果在下一个I/O周期中被串行移出。第一次读数由于内部调整，读取的数据的转换结果可能不准确，应丢弃。

③89C2051通过编程产生串行时钟，并按时序发送与接收数据位，完成通道方式/通道的数据的写入和转换结果的读出，放到定义好的三个区域温度寄存单元，以作Fuzzy PID[1-2]（模糊PID）误差计算和模糊规则表[1-2]的调整和PID参数的修正，且送出精确偏移量到温控执行单元（TC4420M）桥式驱动模件的H/C 和PWM控制端 ，同时将这些数据转化成实时温度供主MPU随时读取实时显示。

四．Tail-PCR 技术特点及Tail-PCR基因扩增仪的原理和扩增程序分析

1.Tail-PCR的意义

TAIL-PCR 即Thermal Asymmetric Interlaced PCR，是一种热不对称交错PCR扩增技术，

目的是为了扩增已知目标序列两端侧翼序列，以取代繁琐的染色体移步法简单快速获得已知序列基因的侧翼序列和启动子序列等，对基因编辑，位图克隆等分子生物学的研究具有非常重大的意义。

2.Tail-PCR 对温度的升降速度的要求和控温精度的要求参数

由于Tail-PCR 反应 至少需要三对不同退火温度的引物[3]，对退火温度的准确性要求很高，切换不同引物扩增时的升降温度既要能够实现慢速（0.1℃/s），又要使温度转换非常快速（5℃/s），并且要求温度控制得既没有过冲又不能滞后。理想得Tail-PCR 仪，应该是把三个不同的扩增温度步骤合并在一个程序中，快速切换退火温度，以适应 三对不同的兼并引物。所以，要求PCR仪具有变温速度可控、内存大以能够实现多重套嵌温度控制程序的运行，并且还要有程序链接功能，因此采用模糊PID控制方式去实现这一特殊要求的功能。

3.模糊温度控制在TAIL-PCR 扩增中的作用

PID控制是一种负反馈闭环控制，如图11所示，控制

偏移量输出信号u（t）是时间t和误差信号e（t）的函数，

与比例因子Kp，积分因子Ki，微分因子Kd 相关 。

式中e（t）=目标设置--实际测量值，是时间t的变量。程序

可以根据公式和经验参数（Kp，Ki，Kd）计算出给定目标设置

温度值计算出相对应的偏移控制量u（t），这里是加载在Peltier

元件上的电流的PWM值。由于环境等因素是不断变化着的，固定的PID参数（Kp，Ki ，Kd）不能应对及时变化给出最合适的控制量。因此，采用模糊控制规则把误差信号制定模糊规则表根据实际误差及其瞬时变化率对固定PID的参数随时调整，这就是模糊（fuzzy）PID控制原理[1]，实现了温度的既精确又灵敏的控制目的，以满足TAIL-PCR 的条件和要求。

4.TAIL-PCR 扩增步骤及程序范例

Tail-PCR 需要进行三段扩增子程序。

第一步：针对第一引物的预扩增。第一引物和兼并引物做非特异性循环10次，高特异性引物扩增做5次循环，再套嵌循环12次；

第二步： 将第一步反应产物大量稀释后再针对第二引物扩增。只将第二特异性引物与兼并引物做10次循环；

第三步：将第二步扩增的产物高倍稀释后做模板，针对第三特异性引物做30次循环扩增。

五．总结分析讨论

该设计系统中，软件和硬件都采用了模块化设计理念，主控MPU将不同的功能分配给不同的功能模块，调用和协调各模块独立工作。

①“智能温控模块”承担了大部分数据采集可控制任务，与主机通过RS232串口快速地实现多点温度的快速巡检和数据读取；

②温度加热致冷控制单元采用传统的H桥驱动模式，由两个半桥电路TC4420M）搭建而成的换向和PWM控制，电路简单易控；

③致冷和加热单元采用高效军用级Peltier致冷模块最大限度地保证了温度的均一性和极高的变温速率；

④温度控制程序采用了fuzzy-PID算法（模糊PID）保证了温度控制的准确性。

⑤主程序还包含DNA模板引物的Tm[3]值计算功能，对用户确定合适的退火温度有一定的参考价值。

总之，本设计所采用的各项技术手段主要是为了满足Tail-PCR 的特殊要求而实施的。根据本设计开发出的仪器投入市场，完全满足设计和使用要求，还有的不足和遗憾之处是目前还没有无线Wifi接口，不能实现远程程序设置和过程监控，这也是今后要改进和努力的方向，我们正向仪器的微型化、智能化，远程化的目标努力。

六．参考文献

[1]余永权，《单片机模糊逻辑控制》[M]，北京：航空航天大学出版社.1995

[2]李士永，《模糊控制.神经控制和智能控制论》[M]，哈尔滨工业大学出版社.1996

[3]吴乃虎，《基因工程控制原理》北京：科学出版社[M].1998

[4]关强，行联合，“智能化多路串行数据采集/传输模块的设计”《世界电子元器件》2007年1期

[5]Bogachek EN.，Landman U.，Scherbakov AG..Nonlinear Peltier effect and thermoconductance in nanowires[J].Physical Review.B.Condensed Matter.1999，60（16）.11678-11682.