【摘要】目的：通过网络药理学研究，初步探索了抗敏止嗽颗粒对支气管哮喘的可能机理，并与动物试验相结合进行验证。方法：本项目拟在前期工作基础上，以BATMAN-TCM数据库为基础，结合生物信息学等技术，获取与支气管哮喘发病密切关联的关键靶标，并将其与气道上皮细胞相互作用关系导入STRING，构建蛋白相互作用网络；应用Cytoscape3.9.1等软件，构建"药效-药效成分-交集靶点"调控关系，以DAVID数据库为基础，开展GO功能及KEGG通路富集研究。应用抗敏止嗽颗粒对其进行治疗，通过ELISA方法测定血清TNF-α，IL-6，IL-1β等指标。结果：获得了抗敏止嗽颗粒的有效组分240个，共获得了1364个候选靶标，其中包括TNF，IL-6，AKT1，ALB，IL-1β等11个。GO功能及KEGG通路富集分析发现，该方对气道上皮细胞中的蛋白表达有正性调控作用，对炎症反应有调控作用；对TNF，MAPK，IL-17等信号传导途径有调节作用。研究发现该方能显著下调小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β的含量（P<0.05），并减轻了小鼠肺部炎症反应。结论：抗敏止嗽颗粒的抗炎效果与TNF-α，IL-6，IL-1β有关，从而达到减轻气喘的目的。

【关键词】网络药理学；动物实验；抗敏止嗽颗粒；治疗；支气管哮喘

1资料与方法

1.1抗敏止嗽颗粒的活性成分及相关靶点筛选

采用“炙麻黄”、“乌梅”、“防风”、“紫苏子”、“紫菀”、“五味子”、“地龙”、“紫苏叶”、“蝉蜕”、“枇杷叶”、“款冬花”等作为主要搜索词语，通过BATMAN-TCM数据库进行分析，将Scorecutoff>20，AdjustedP值<0.05，对其进行药效物质基础和作用靶标的研究。利用UniProt数据库对靶标进行规范化。

1.2哮喘相关靶点筛选

以"Asthma""BronchialAsthma"作为关键字，搜索GeneCards数据库，OMIM数据库，筛选出与哮喘密切相关度大于2倍的靶点群作为候选靶标，对所搜索的靶标进行联合降重。利用UniProt数据库对致病靶标进行规范化。

1.3“药物-活性成分-交集靶点”网络构建

利用Venny2.1.0网络分析技术，将其与靶基因进行关联分析，得到的交集就是抗敏止嗽颗粒可能的靶标。采用Cytoscape3.9.1，建立“中药-药效成分-交集-靶标”的调控关系，按数值大小进行有效组分的优选。

1.4交集靶点PPI网络构建

将交叉靶标输入STRING数据库，获取交集靶标之间的交互作用，设定中间的可信度大于0.4来构造一个PPI网络，采用Cytoscape3.9.1对其进行了拓扑结构的研究，采用“均值4×4”作为评价指标，对其进行了初步的研究。

1.5 GO功能及KEGG通路富集分析

以DAVID数据库为基础，采用GO和KEGG通路富集对抗敏止嗽颗粒干预后的关键靶标进行GO和KEGG通路富集，设定“Homosapiens”（P<0.01）。GO的功能浓缩由生物过程、细胞成分和分子功能三大模块组成，按照logP数值对各项目进行了分类，选出10个最具代表性的模块进行可视化处理；将最前面的20个路径按照count的数值创建一个气泡图。

1.6统计学方法

所得资料以SPSS25.0为统计工具。对所得资料进行了正态性和方差齐性的检定，符合正态分布的计量资料以表达；以一因子变异数进行多组对比。P<0.05表示有显著性差别。

2结果

2.1抗敏止嗽颗粒有效成分及相关靶点的筛选

通过BATMAN-TCM数据库，共得到抗敏止嗽颗粒的组分群240个，得到1364个与有效组分相对应的靶标。

2.2抗敏止嗽颗粒与支气管哮喘交互作用靶标的获得

利用GeneCards、OMIM等数据库，对各靶标进行联合降重，共得到1077个靶标。将中药与病变靶标进行交叉分析，得到抗敏止嗽颗粒与哮喘作用交叉的靶点269个。

2.3建立“中药-药效成分-交集-靶标”的网络

利用Cytoscape3.9.1，建立"中药-药效成分-交集-靶标"的调控关系。按照数值对有效成份进行优选，其中油酸（数值为90）、紫菀酮（数值为80）和诺卡酮（数值=78）为数值最高的有效成份。

2.4交集靶点PPI网络分析

通过STRING数据库构建PPI网络，网络包括269个节点，5208条边。采用Cytoscape3.9.1软件对蛋白互作网络进行拓扑结构解析，选取11个关键靶标（TNF、IL-6、AKT1、ALB、154），采用“度值112”作为评价指标，对其中11个关键靶标（TNF，IL-6，172，AKT1，164）进行验证。

2.5 GO功能与KEGG通路富集分析结果

基于DAVID数据库，通过GO的功能性富集，获得了3212条基因。在这些研究中，涉及到炎症反应，正调控蛋白磷酸化，脂多糖反应等共2824项；细胞成分包括膜筏、细胞膜微区和胞质小囊体等130余种。根据logP数值对其进行了分类，选取了10个最具视觉效果的指标。

KEGG通路富集技术获得214个与肿瘤发生发展密切相关的下游分子，其中以TNF，PI3K-Akt，MAPK，IL-17为主。

2.6实验结果

2.6.1各组小鼠肺组织病理变化

HE染色结果显示，正常对照组的肺泡壁为一层完整的单层上皮，其形态清楚，细支气管的形态及形态未见异常。观察到在动物实验中，小鼠肺泡壁有较大的厚度和较多的炎症细胞的浸润。模型组小鼠可见肺泡壁大面积明显增厚，气管周围可见大量炎性细胞浸润。与模型组比较，地塞米松和抗敏止嗽颗粒均能明显减轻小鼠的肺泡壁厚度，减轻炎症细胞的侵袭。我们前期研究发现，地塞米松组和抗敏止嗽颗粒低、中、高剂量组均有不同程度的变化。

2.6.2各组小鼠血清炎症因子水平比较

与正常对照组相比，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-1β及IL-6的含量均明显增高（P<0.01）；与模型组相比，地塞米松组和抗敏止嗽颗粒低、中、高剂量组的血清血清中TNF-α、IL-1β及IL-6的含量均低于正常对照组（P>0.05）；抗敏止嗽颗粒治疗组与地塞米松组相比，血清中TNF-α、IL-1β及IL-6含量均未见显著变化（P>0.05）。

3讨论

本课题组前期研究发现，抗敏止嗽颗粒不同浓度的中药复方制剂能明显减少TNF-α、IL-1β及IL-6的含量，抑制肺部的炎性反应。但是，由于本次试验的样本数量和动物对试验药物的敏感性存在一定的差别，因此，在以后的研究中还需要深入研究。

结论：总之，通过体内、外实验，明确该方的药效物质基础和关键信号途径，以期阐明该方的药效物质基础，并为研发新型高效的抗敏止嗽颗粒奠定基础。

参考文献：

[1]于明坤，柴倩云，梁昌昊，丁砚秋，林子宜，高佳琪，王涵，张立山，刘建平，费宇彤.新型冠状病毒肺炎中医预防及诊疗方案汇总分析[J].中医杂志，2020，61（5）：383-387.

[2]夏文广，安长青，郑婵娟，张继先，黄敏，王喻，杨丰文，段璨，李正良，刘清泉，张伯礼.中西医结合治疗新型冠状病毒肺炎34例临床研究[J].中医杂志，2020，61（5）：375-382.

[3]郑文科，张俊华，杨丰文，王玉光，刘清泉，张伯礼.中医药防治新型冠状病毒肺炎各地诊疗方案综合分析[J].中医杂志，2020，61（4）：277-280.

柯桂兰，女，汉族，1969年1月，大专，副主任中药师，研究方向：药学。