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【摘要】目的：探讨透骨血竭散内服对类风湿性关节炎（RA）模型大鼠炎症因子的影响及作用机制分析。方法：选取无特定病原体（SPF）雄性SD大鼠60只作为研究对象，按随机数字表法将其分成5组，正常组、模型组、阳性对照组、透骨血竭散外敷组和透骨血竭散内服组，每组各12只。根据各组大鼠炎症因子表达情况分析其与RA的作用机制。结果：①透骨血竭散内服组SD大鼠的足趾肿胀程度显著低于透骨血竭散外敷组（P＜0.05）。②阳性对照组、透骨血竭散外敷组和透骨血竭散内服组分别予以扶他林软膏外敷、透骨血竭散（外敷、内服）后TNF-α、IL-1β、TGF-β1表达均显著下降（P＜0.05）。结论：透骨血竭散内服能更好的抑制RA大鼠的TNF-α、IL-1β、TGF-β1等炎性因子过表达，减轻机体炎性反应，保护SD大鼠机体免受类风湿因子及其他病毒的破坏，改善关节功能，其机制可能与TLR4/NF-kB信号通路活化有关。

【关键词】透骨血竭散内服；类风湿性关节炎；炎症因子；TNF-α；IL-1β；TGF-β1；关节功能；

【Abstract】Objective： To investigate the effect of internal administration on inflammatory factors in rheumatoid arthritis （RA）. Methods： Six male SD rats without specific pathogen （SPF） were selected as study subjects and divided into 5 groups according to random number table. Normal group， model group， positive control group， external drainage group and internal drainage group were 12 rats in each group. The mechanism of action with RA was analyzed according to the expression of inflammatory factors in each group. Results： ①The toe swelling in SD rats was significantly lower than that in the  group （P <0.05）.② The expression of TNF- α， IL-1 β， and TGF- β 1 were decreased significantly after external application of positive control group， drainage group and drainage group， respectively （P <0.05）..Conclusion： Oral administration of Tougu Xuejie Powder can better inhibit  in RA rats TNF-α、IL-1β、TGF-β The overexpression of inflammatory factors such as TLR4/NF- kB may reduce the inflammatory response of the body， protect the body of SD rats from the destruction of rheumatoid factors and other viruses， and improve joint function. The mechanism may be related to the activation of TLR4/NF-kB signal pathway.

[Key words] Internal drainage; rheumatoid arthritis; inflammatory factors; TNF-α; IL-1β; TGF-β1; joint function

通常而言，RA病程发展缓慢，病因复杂，机体致残率较高。作为一种带有显著炎性特征的可累及周身关节的慢性代谢性疾病，西医认为，RA与遗传、免疫、环境等[1]因素关系密切，但具体病机如何目前尚未完全弄明。对RA的中医药诊治，名中医马拥军导师颇有心得，他处方灵活，师古不泥，疗效显著，受到了广大患者的肯定。马拥军导师认为，RA多属本虚标实，风、寒、湿、热是外部因素，正气不足，诸虚存内[2-3]才是其发病的关键。据统计，RA发病不受任何年龄限制，女性居多，国内发病率为0.3～0.5%[4-5]。但随着细胞分子学、免疫学技术的进步与研究的逐步深化，越来越多的研究数据证实，各种参与炎症反应的细胞因子，在外界因素的刺激下会产生免疫应答分泌大量的炎症因子（如TNF-α、IL-1β、TGF-β1等[6]在RA进展中的作用举足轻重），将其传递给朗格汉斯细胞（Langerhans cell，LCs）激活更高级的免疫细胞（如巨噬、淋巴、肥大等[7-8]细胞组织），杀伤致病菌。同时若机体自身调节能力失衡，这些免疫细胞可能进一步释放炎症因子，引发更大的炎症反应。血竭散在《博济方》、《疡科选粹》等典籍中均有记载，在《云岐子保命集》和《校注妇人良方》中称作夺命散、夺命丹。胡筱薇[8]临床研究表明治杖疮、夹伤，败血冲心，胸满上喘，语言颠倒，健忘失志等均有疗效显著。马拥军导师通过多年的临床实践并结合现代药理学研究证实，透骨血竭散在RA治疗方面收效良好，但多以外敷的形式出现，而尚无内服的临床案例，故马拥军导师在前期基础研究中针对不同透骨血竭散内服剂量的小鼠进行了观察，三组1.6g/kg、0.8g/kg、0.4g/kg内服小鼠疗效均与外敷小鼠疗效接近，其中0.8g/kg作用较为突出，故本次研究在马拥军导师前期基础研究上进一步通过动物试验探析透骨血竭散与RA炎性因子表达及其作用机制，观察0.8g/kg内服透骨血竭散小鼠的相关指标。报道如下所述：

1资料与方法

1.1 实验资料：SPF级斯泼累格·多雷（Sprague Dawley）大鼠60只，年龄：6～8周，体质量300～350（330.25±25.64）g，购自重庆医科大学动物中心，饲养环境：常规饲养，自由进食，室温22～24℃，相对湿度50～70%，试验前适应性喂养1周。实验过程中对60只SD大鼠的处理严格按照动物实验伦理要求进行，符合《关于善待实验动物的指导性意见》[9]中的饲育、应用、运输及相关措施和《中国动物保护法制建设白皮书》[10]相关规定。比较五组SD大鼠初次免疫后1～5周时的体质量、双后肢足趾容积、关节炎症评分及TNF-α、IL-1β、TGF-β1表达。

1.2 实验方法：

扶他林软膏：外用，按痛处面积大小确定使用剂量，每次使用扶他林软膏剂（批准文号：国药准字H10980297）约3～5cm或更多，轻揉搓使渗透如SD大鼠皮肤。

透骨血竭散：药物组成：透骨草、补骨脂、艾叶、当归、桂枝、忍冬藤各10g，青风藤9g，土鳖虫、白芥子、白芍、红花、血竭各6g。药物比例搭配之后，将其分成两份，一份研磨成粉末，用清水调成膏状，待用；一份加适量清水煎煮，取适量药汁，待用。给予大鼠口服剂量为0.8g/kg。

主要试剂与仪器：①试剂：TNF-α、IL-1β、TGF-β1 ELISA试剂盒购自武汉艾美捷科科技有限公司，DAB显色剂、VEGF和ApoA-1一抗、枸橼酸盐缓冲液、抗体稀释液均购自博士德公司，PV-9000二抗购自中杉金桥公司，Ⅱ型胶原购自美国Chondrex公司。②仪器：酶标仪（型号：DNM-9606）、分光光度计（型号：721）、台式低速离心机（型号：Cenlee 4K）、超低温冷动储存箱（型号：DW-HI528S）、组织脱水机（型号：JT-12J）、石蜡包埋机（型号：JB-L6）、生物组织摊烤片机（型号：JK-6）、超纯水机（型号：ZWL-PAI-20）分别购自北京普朗新技术、上海菁华科技、湘立科学仪器、中科美菱低温科技股份、武汉俊杰电子、武汉俊杰电子、武汉俊杰电子、中沃水务环保科技，显微镜购自日本尼康公司。等。

动物分组与模型制备：所购的60只SD大鼠均按随机数字表法将其分成5组，即正常组、模型组、阳性对照组、透骨血竭散外敷组和透骨血竭散内服组，各12只。正常组（12只）不予以任何方式干预，其余四组SD大鼠均采用Ⅱ型胶原诱导型关节炎造模法制备成RA模型。具体操作方法如下所述：在事先备好的0.02mol/L乙酸中滴加适量Ⅱ型胶原，放置在4℃环境下（过夜）使其溶合混匀，再制作成乳剂（与等量弗氏佐剂（按1：1）混合，在冰浴条件下充分乳化），取乳化后的混合物注射（注射剂量：0.1mL/只）在SD大鼠的尾根皮下组织，注射后第7天，以相同剂量、相同部位再次免疫[11-12]。根据大鼠模型关节炎指数（AI）评分判定相关模型是否造模成功（造模成功：SD大鼠后肢后趾红肿，踝关节体积明显增大）。AI评分≥6分（包括爪和趾（指）在内的整个爪评分之和，具体评分参照文献[8]）为造模成功。评估时间：初次免疫后第21天末。将造模成功后的SD大鼠随机分成模型组、阳性对照组、透骨血竭散外敷组和透骨血竭散内服组，各12只。造模成功并分组后第2天开始给药。正常组与模型组不予处理（予以等量生理盐水干预，1次/d，连续4周），阳性对照组予以扶他林软膏外敷，具体用法用量参1.2；透骨血竭散外敷组，将研磨成粉末，用清水调成膏状，适量涂抹在SD大鼠的病变部位的皮肤之上；透骨血竭散内服组，适量清水煎煮，取适量药汁，用药管经口内服。阳性对照组、透骨血竭散外敷组和透骨血竭散内服组每天给药1次，持续2周。给药期间，所有SD大鼠均自由饮水与摄食，每天称重1次。最后1次给药后对所有SD大鼠进行禁食不禁水干预，24小时后处死。

体质量检测：从第2次免疫成功（给药干预第0天）开始，每隔1周对五组SD大鼠进行1次体质量检测，记录相应数据。

足趾肿胀度检测：从第2次免疫成功（给药干预第0天）开始，每隔1周运用水溶剂法测量1次SD大鼠的右后足容积，记录相应数据。

关节炎指数检测：从第2次免疫成功（给药干预第0天）开始，每隔1周用5级评分法评估SD大鼠关节炎指数，最高16分（所有关节炎指数之和），参照文献[13]拟定。

ELISA检测：每周取五组SD大鼠的踝关节滑膜组织匀浆及腹主动脉全血适量进行离心处理（离心温度：4℃，离心速率：4000r/min，离心时间：10min）并提取上清液及血清后按照TNF-α、IL-1β、TGF-β1 ELISA试剂盒操作说明检测，获取TNF-α、IL-1β、TGF-β1等炎性因子的表达数据。

Real-time PCR检测：TLR4/NF-B 信号通路相关分子表达：以TRIzol 试剂（Invitrogen"TMThermoFisher Scientific）提取SD大鼠的踝关节滑膜组织总RNA，逆转录合成CDNA，以之为模板行 realime PCR 扩增（相关试剂均为 Takara Bio Inc.产品），本研究采用的序列均经NCBIBLAST 软件验证，由华大基因股份有限公司合成以非SD大鼠的踝关节滑膜组织作为阴性对照使用Applied Biosystems 7500快速实时荧光定量PCR系统（Thermo Fisher Scientific）行PCR扩增，反应条件：95C10min;95C 10 s，60C30s，45个循环;熔解曲线65～95C。2-AACt法计算目的基因mRNA 相对表达量。

1.3 观察指标

关节炎症评分：初次免疫成功后第2、3、4、5周进行关节炎症评分[14]，0分=无关节炎症，1分=单个爪或趾（指）红肿，2分=两个关节红肿，3分=3个及以上关节红肿，4分=全部关节红肿。关节炎症评分为趾（指）相加之和，最高16分，最低0分。AI（关节炎指数）≥6分为造模成功。

1.4 统计学方法：建立Excel数据库，将各基线资料、研究数据纳入SPSS21.0软件处理。计数资料用x2检验。计量资料用t检验，两个及两个以上样本均数差异的显著性检验用变异数分析（F检验），以（±s）表示。差异有统计学意义（P＜0.05）。

2 结果

2.1 五组SD大鼠关节炎程度比较：表1、表2所述，五组治疗前后体质量相比，差异无统计学意义（F=0.13、0.23、0.26、0.19、0.21、0.15，P＞0.05）。与正常组组相比，造模第21d时模型组SD大鼠足趾肿胀程度较阳性对照组、透骨血竭散外敷组和透骨血竭散内服组显著升高（t=6.147、7.687、8.147，P=0.000、0.000、0.000），而予以透骨血竭散治疗21d后，透骨血竭散内服组SD大鼠的足趾肿胀程度显著低于透骨血竭散外敷组（t=5.147，P=0.001）。

图注：图A：RA低倍镜图（×100），滑膜组织中有大量炎性细胞浸润和血管生成，滑膜衬里层增厚极其明显；图B：RA高倍镜图（×400），血管和炎性细胞明显；图C：OA低倍镜图（×100），透骨血竭散内服后炎性细胞和血管不明显，滑膜衬里层较薄；图D：OA高倍镜图（×400），骨血竭散内服后血管和炎性细胞不见。

2.2 五组不同时期的关节炎评分比较：表3所述，与正常组相比，模型组造模后21d时的关节炎症评分显著升高，足趾肿胀明显（t=8.654，P=0.000）。予以透骨血竭散治疗14d时，较之模型组，透骨血竭散外敷组和透骨血竭散内服组的关节炎症评分显著降低（t=7.914、8.914，P=0.000、0.000），透骨血竭散内服组予以治疗7、14d时的关节炎症评分略低于透骨血竭散外敷组，但差异不显著（P＞0.05）。

2.3 五组治疗21、35d时TNF-α、IL-1β、TGF-β1表达比较：表4所述，与正常组相比模型组造模后21d时模型组、阳性对照组、透骨血竭散外敷组和透骨血竭散内服组的TNF-α、IL-1β、TGF-β1表达均显著升高（F=35.92，18.81，30.39，P=0.000、0.000、0.000），35d时，阳性对照组、透骨血竭散外敷组和透骨血竭散内服组分别予以扶他林软膏外敷、透骨血竭散（外敷、内服）后的TNF-α、IL-1β、TGF-β1表达均显著下降（F=76.61，67.50、68.79，P=0.000、0.000、0.000）。

2.5 五组治疗21、35d时TLR4mRNA 、NF-κB mRNA表达比较：表5所述，与正常组相比模型组造模后21d时模型组、阳性对照组、透骨血竭散外敷组和透骨血竭散内服组的TLR4mRNA、NF-κB mRNA表达均显著升高（P＜0.05），35d时，阳性对照组、透骨血竭散外敷组和透骨血竭散内服组分别予以扶他林软膏外敷、透骨血竭散（外敷、内服）后的TLR4mRNA、NF-κB mRNA表达均显著下降（P＜0.05）。

3 讨论

作为一种自身免疫系统疾病，RA的致残率较高，严重影响患者的生活质量。大量研究数据佐证，RA在发生过程中伴有大量的炎症因子释放，经常伴有关节外器官累计及血清类风湿因子阳性[15]可致手、足、膝、髋等关节畸形及功能丧失。治疗原则包括健康宣教、早期治疗、联合用药、个性化治疗方案及功能锻炼。近十年来，关节外病变的治疗与新疗法的不断问世，RA预后有了明显改善，随着慢性抗风湿药物的联合应用（尤其是早期），大多数RA患者病情能得到很好控制，减轻甚至是治愈[16-17]。研究发现，某些炎性指标对RA病情有预估和指导用药作用，可根据RA发病第一年的临床特点来大致判断预后。

透骨血竭散是在血竭散的基础上演变而来，由透骨草、补骨脂、艾叶、当归、桂枝、忍冬藤、青风藤、土鳖虫、白芍、红花、血竭及白芥子等十二味中药组成。目前将其用于RA治疗的方式多以外敷为主，从检索文献来看，几乎没有以内服的方式治疗RA的案例。通过本文研究结果来看，透骨血竭散能显著改善SD大鼠模型的RA症状，透骨血竭散能有效抑制TNF-α、IL-1β、TGF-β1等炎性因子过表达。李梅等[18]证实，模型组（SD大鼠模型）的胸腺指数和脾脏指数与正常组（SD大鼠）相比显著升高，说明Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）及其介导的核因子-kB（Nuclear factor-kB，NF-kB）信号通路参与了RA患者的炎性反应，介导炎性因子表达[19]。这标志着RA大鼠免疫系统被激活，局部抗原发生改变，炎症因子在滑膜组织中大量释放，从而导致滑膜炎症的发生，模型组大鼠胸腺指数和脾脏指数均比正常对照组有明显上升。透骨血竭散中的透骨草、青风藤、红花、当归、艾叶、血竭有舒筋活骨、祛风活血之效，IL-1β常与TNF-α同时合成分泌，共同破坏关节软骨而引起关节损伤，透骨血竭散能有效改善因IL-1β、TNF-α过表达所损伤的关节软骨组织。周凌燕等[8～10]发现，透骨血竭散可通过改善载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）形态而抑制TNF-α、IL-1β等促炎因子的表达，同时透骨血竭散可抑制RA患者血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）生成。在RA进程中起主要作用的炎性介质是IL-1β、IL-6和TNF-α，它们刺激软骨细胞和滑膜细胞分泌胶原酶等破坏软骨细胞周围环境的物质，透骨血竭散中的桂枝、白芥子、白芍、松节有温经通阳、散寒止痛，可调节大鼠血清和踝关节等组织中的IL-1β、IL-6和TNF-α过表达[11～13]。补骨脂、土鳖虫、血竭补肾壮阳、舒筋接骨，可促进RA患者局部血液循环[14～18]。从本文来看，透骨血竭散治疗1～3周后透骨血竭散内服组的足趾肿胀程度显著低于透骨血竭散外敷组（P＜0.05），治疗7、14d时的关节炎症评分略低于透骨血竭散外敷组，无统计学意义（P＞0.05），这反映透骨血竭散内服对TNF-α、IL-1β、TGF-β1等炎性因子的抑制作用更明显，透骨血竭散内服主要依靠肠道消化（吸收、分布、代谢、排泄等）参与病变部位作用，可通过血液循环将透骨血竭散的有效成分，输送至不同的病变组织，更快的抑制TNF-α、IL-1β、TGF-β1表达，改善SD大鼠的关节功能[19～22]。外敷主要依靠皮肤、黏膜细胞渗透吸收，能有效降低透骨血竭散对SD大鼠胃肠道的刺激，避免破坏消化酶，可减轻肝脏和肾脏负担。两者的差异可能与药理作用部位和起效速度有关，希望未来有机会展开更深层次的研究，为其提供更详实、权威的依据。此外本次研究的前期实验中发现低、中、高剂量透骨血竭散内服均能显著减轻RA大鼠的关节肿胀程度，故本次研究采取了0.8g/kg中剂量进行研究，具体对TLR4/NF-kB信号通路的影响差异有待后续研究进一步证实。

综上所述，透骨血竭散内服更好的抑制RA大鼠的TNF-α、IL-1β、TGF-β1等炎性因子过表达，减轻机体炎性反应，保护SD大鼠机体免受类风湿因子及其他病毒的破坏，改善关节功能，其机制可能与TLR4/NF-kB信号通路活化有关。但本文同样也存在不足，一是研究样本量偏低，二是缺乏创伤修复模型的发生、发展机制与疗效机理，故希望为再来的工作、学习中予以进行针对不足进行修正。

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