摘要：随着抗生素的广泛应用，细菌耐药性问题日益严峻，耐药基因检测技术在临床微生物检验中发挥着越来越重要的作用。本文综述了近年来耐药基因检测技术在临床微生物检验中的应用进展，包括 PCR 技术、高通量测序技术、纳米孔测序技术、质谱检测技术等，分析了这些技术的原理、优势及局限性，并探讨了其在耐药基因检测中的应用现状及发展趋势。

关键词：耐药基因检测；PCR 技术；高通量测序；纳米孔测序；质谱检测

1 引言

抗生素的发现和应用极大地改善了人类的健康状况，但随着抗生素的广泛使用，细菌耐药性问题日益凸显。耐药基因的存在使得细菌能够抵抗抗生素的作用，导致感染性疾病的治疗难度增加，治疗周期延长，甚至出现无药可治的情况。因此，准确、快速地检测耐药基因对于指导临床合理用药、控制耐药菌的传播具有重要意义。

2 PCR 技术在耐药基因检测中的应用

2.1 PCR 技术原理

PCR 技术是一种基于DNA 复制原理的体外扩增技术，通过引物与模板 DNA 的特异性结合，在DNA 聚合酶的作用下，对目标 DNA片段进行扩增。该技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，广泛应用于耐药基因的检测。

2.2 单重PCR 在耐药基因检测中的应用

单重 PCR 技术主要用于检测单一耐药基因。例如，对于葡萄球菌的甲氧西林耐药基因 mecA 的检测，单重 PCR 具有较高的灵敏度和特异性。研究表明，检测金黄色葡萄球菌对甲氧西林耐药时，以PCR 为对照，表型方法中与 PCR 的符合率可以达到 100% 。在凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）中，由于 mecA 基因的异质性表达，表型方法与基因型的符合率相对较低，而 PCR 检测则能更准确地反映耐药情况。

2.3 多重PCR 在耐药基因检测中的应用

多重 PCR 技术能够同时检测多个耐药基因，特别适合于临床多指标的检验。例如，韩国研究者发展的 4 重 PCR 能够同时检测葡萄球菌中介导 2 种耐药性的 4 个耐药基因，包括甲氧西林耐药基因mecA、氨基糖苷类耐药基因 aac（6'）-aph（2"）、aph（3"）-Ⅲa、ant（4"）-la。研究表明，在金黄色葡萄球菌和 CNS 中，基因扩增与表型耐药结果的符合率较高。此外，还有报道用 9 重 PCR 进行耐药基因检测，能够检测金葡菌中多个耐药基因介导的对不同类别抗生素的耐药性。

3 高通量测序技术在耐药基因检测中的应用

3.1 全基因组测序（WGS）

WGS 是指获得一个物种全基因序列的过程。在细菌耐药性检测领域，WGS 可以提供细菌全面的耐药基因谱，并通过耐药基因预测其耐药表型，揭示相关耐药机制。多项研究对 WGS 和表型抗生素敏感性试验（AST）检测细菌耐药性进行对比，结果呈高度一致性，证明了通过 WGS 预测细菌耐药性的准确性。此外，WGS 还能鉴定耐药细菌基因组中染色体和质粒编码的抗生素耐药基因，有助于了解耐药基因的移动和传播背后的机制，对耐药菌株的爆发流行进行监控。然而，WGS 检测周期较长，价格较贵，且样本需要纯细菌培养物，对临床细菌的鉴定分离要求较高。

3.2 宏基因组测序（mNGS）

mNGS 是通过高通量测序技术检测特定环境样品中微生物群体的基因组信息。通过生物信息学分析方法进行病原体鉴定、微生物组分析、宿主相互作用分析和细菌耐药性预测。在临床细菌耐药基因检测中，mNGS 能诊断未知病原体的感染，并挖掘其耐药基因，为临床合理使用抗生素提供参考。例如，基于 mNGS 技术，有研究在免疫功能低下的重症肺炎患者的培养阴性肺组织样本中鉴定出肺炎克雷伯菌，并进一步鉴定出多种抗性基因。此外，mNGS 还可用于新型耐药基因的检测。然而，mNGS 成本高，步骤复杂，缺乏标准化和自动化的分析流程，对细菌耐药基因的大规模筛查较为困难。

4 纳米孔测序技术在耐药基因检测中的应用

4.1 纳米孔测序技术原理

纳米孔测序技术是一种基于纳米孔的单分子测序技术，通过测量DNA 分子通过纳米孔时电流的变化来确定 DNA 序列。该技术具有读长长、速度快、可直接检测原始样本等优点，适用于耐药基因的快速检测。

4.2 纳米孔测序在耐药基因检测中的应用实例

一项多中心临床研究建立了适用于从尿液中检测病原体及耐药基因的实验流程及生信分析方法，并收集来自多中心的1045 例样本进行性能验证。结果表明，纳米孔宏基因组技术可以快速、准确地检测出尿路感染病原体和耐药基因。该研究开发的 NanoAMR 流程能够高灵敏度地检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药和 ESBL阳性表型相关的基因。例如，在培养结果为大肠埃希菌的样本中，表现为碳青霉烯耐药表型的3 个尿样中，纳米孔测序在2 个样本中检测到了blaNDM 基因；表现为ESBL 阳性的43 个尿样中，纳米孔测序在 37 个样本中检测到 blaCTX-M 基因，其中最常见的是blaCTX-M-14。

5 质谱检测技术在耐药基因检测中的应用

5.1 质谱检测技术原理

质谱检测技术基于细菌独特的蛋白质组成来发挥作用。在具体操作中，首先利用大量已知菌种构建完备的数据库，这些菌种涵盖了临床常见的各类微生物。进行检测时，通过质谱仪器对目标细菌进行处理，使细菌中的核糖体蛋白等成分发生电离，形成带电离子。这些离子在电场和磁场的作用下按照质荷比的不同进行分离，从而获得细菌核糖体蛋白的指纹图谱。

5.2 质谱检测在耐药基因检测中的局限性

尽管微生物质谱检测在微生物种属鉴定方面表现出色，但在耐药基因检测中存在明显的局限性。一方面，微生物质谱检测目前主要应用于微生物的快速种属鉴定，它无法直接提供明确可靠的药敏结果。细菌的耐药机理十分复杂，耐药性不仅与细菌是否携带耐药基因有关，还受到基因表达水平、细菌代谢状态、细胞膜通透性等多种因素的影响。即使细菌携带耐药基因，也不一定表现出耐药表型，因此仅依靠质谱检测获得的与耐药性相关的部分信息，难以准确判断细菌对特定抗生素的耐药情况。

6 结语

耐药基因检测技术在临床微生物检验中发挥着重要作用，为临床合理用药、控制耐药菌的传播提供了有力支持。PCR 技术、高通量测序技术、纳米孔测序技术、质谱检测技术等在耐药基因检测中各有优势和局限性。随着技术的不断发展，耐药基因检测技术将更加准确、快速、便捷，为临床微生物检验和耐药菌防控提供更有效的手段。

参考文献：

[1]吴茜，张翔峰，李海洋，等.西藏地区藏猪源大肠杆菌耐药性及耐药基因检测与分析[J/OL].畜牧兽医学报，1-10[2025-06-17].

[2]廖娟，章文欣，沈雪梅，等.鸡源沙门氏菌的分离鉴定及耐药基因和毒力基因检测[J].江苏农业科学，2025，53（08）：184-191.