摘要 目的 建立8种医院中药制剂微生物限度检查法。方法 根据《中国药典》2020版四部通则，1105-1107进行8种医院中药制剂微生物限度检查方法适用性试验。结果 采用1：10供试液平皿法测定8种中药制剂的需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数以及采用控制菌常规法进行控制菌检查，所建立的检查方法对5种试验菌株的回收比值在0.2～0.5之间，试验组控制菌均可检出，阴性对照组均未检出，符合《中国药典》要求。结论 建立的方法准确可靠，可以用以8种医院中药制剂微生物限度检查。

关键词： 医院中药制剂；微生物限度检查；方法适用性试验

中图分类号 R927.11   文献标识码 A

医院中药制剂是老中医临床治疗经验的重要载体[1]，因其具有丰富的临床使用经验及其可靠的疗效，近年来成为医疗机构制剂重点发展方向[2]。中药制剂原材料多为植物药和动物药，特别是含药材原粉的制剂，存在微生物污染等风险较高[3]，李得堂等[4]提出，预防微生物污染是医院中药制剂质量控制的关键环节之一。Renhui YANG等[5]在建立两种医院中药制剂运脾颗粒和补脾强力片的微生物限度检查方法的工作中，发现两种制剂均能够抑制金黄色葡萄球菌生长。杨燕等[6] 通过建立44种常用儿童制剂的微生物限度检查方法，发现中成药通常对细菌，特别是对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有一定抑菌作用，而对白色念珠菌和黑曲霉基本无抑菌作用。提示了在中药制剂的微生物限度方法适用性工作中，霉菌和酵母菌总数的测定可以直接采用常规（1：10）平皿法进行。刘钰等[7]在建立加味消毒饮颗粒微生物限度检查方法的工作中，发现采用常规法（1：10）制备供试液检查需氧菌总数时，试验菌回收值小于0.5，而当供试品稀释制成1：20的供试液时，回收比值均大于0.5。因此，本研究根据《中国药典》2020年版四部通则“非无菌产品微生物限度检查”[8]，对8种含药材原粉的医院中药制剂需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数以及控制菌检查进行方法适用性试验，并对结果进行分析和评价，以期为药品检验机构中药制剂微生物限度检查方法提供有效参考，从而加强医疗机构中药制剂的质量控制，提高用药的安全性和有效性。

1材料与方法

1.1供试品

痤疮消丸、补肾强身丸、丹曲降脂丸、妇炎丸、化痰散结丸、精道排毒丸、益气解毒丸（批号：20230302）、治胃丸，8种中药制剂均来自三亚市中医院。

1.2实验试剂和菌株

（1） 培养基 胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB ）、沙氏葡萄糖琼脂（SDA ）、麦康凯液体培养基（MB）、麦康凯琼脂培养基（ MA）、RV沙门增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（XLD）、肠道菌增菌液体培养基、紫红胆盐葡萄琼脂培养基、 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（稀释液），以上培养基和试剂均购自广东环凯微生物技术有限公司。

（2）试验菌株 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）260003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、 枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50094]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]，以上菌株均为第3代，来源于中国食品药品检定研究院。

1.3主要仪器设备

高压蒸汽灭菌锅（Panasonic）、超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）、单道可调移液器（德国艾本德股份公司）、生化培养箱（上海一恒科技有限公司）、生化培养箱（BINDER）。

1.4 实验方法

1.4.1菌液制备

参考《中国药典》2020年版 四部制备菌液[8]。

1.4.2供试液的制备

取供试品10 g，加入无菌PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，均质混匀，制成1：10的供试液，用同一稀释液将供试液进一步稀释，制成1：20的供试液。

1.4.3 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数的方法适用性试验

⑴需氧菌总数计数

试验组：分别取1：10、1：20的供试液各10 mL至无菌空试管中，分别加入铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉孢子菌悬液 0.1 mL，制成每1 mL供试液中含菌量不大于100 cfu的试验组供试液，混匀，取1 mL注入平皿中，立即倾注温度不超过45 ℃ TSA培养基约20 mL，待凝固后，倒置，34 ℃培养3 d，计菌落数，各试验平行2个皿。菌液对照组：取无菌PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液5份，每份10 mL，每份中分别加入的菌悬液与试验组相同，其余的操作步骤同试验组。供试品组：分别吸取1：10、1：20的供试液各1 mL分别注入平皿中，其余的操作步骤同试验组。另外2个平皿倾注温度不超过45 ℃ SDA培养基约20 mL，待凝固后，倒置，23 ℃培养5 d，计算其菌落数。阴性对照：取2个平皿，分别加入稀释液1 mL，2个平皿倾注温度不超过45 ℃ TSA培养基约20 mL，待凝固后，倒置，34 ℃培养3 d，计算其菌落数。另外2个平皿倾注温度不超过45 ℃ SDA培养基约20 mL，待凝固后，倒置，23 ℃培养5 d，计算其菌落数。

⑵霉菌和酵母菌计数

试验组：用移液枪吸取（1）项下“试验组”中，含有白色念珠菌、黑曲霉孢子菌悬液的1：10供试液1 mL，分别注入平皿中，立即倾注温度不超过45 ℃ SDA培养基约20 mL，待凝固后，倒置，23 ℃培养时间不超过5 d，计算菌落数，各试验平行2个皿。菌液对照组：分别吸取（1）项下“菌液对照组”所制备的白色念珠菌、黑曲霉孢子的PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液各1 mL，分别注入平皿中，每种菌液制备2个平皿，其余的操作步骤同试验组。供试品组：吸取1：10的供试液1 mL分别注入平皿中，其余的操作步骤同试验组。阴性对照：取2个平皿，分别加入稀释液1 mL，每个平皿倾注温度不超过45 ℃ SDA培养基约20 mL，待凝固后，倒置，23 ℃培养5 d，计数。

（3）结果计算

试验回收比值按以下公式计算：各菌株回收比值=（试验组的平均菌落数−供试品对照组的平均菌落数）/菌液对照组的平均菌落数。

1.4.5控制菌检查

（1）大肠埃希菌

试验组：取1∶10的供试液10 mL和1mL含大肠埃希菌不大于100 cfu的菌悬液接种至100 mL的TSB中，34 ℃培养18 h，取上述培养物 1 mL 接种至 100 mL 的 MB 中，43 ℃培养24 h后划线接种于MA平板上，34 ℃培养18 h。菌液对照组：不含供试液，其余操作同试验组。供试品对照组：不加试验菌，其余步骤同试验组。阴性对照：取稀释液10 mL转接至100 mL TSB中，不加入菌悬液，其余步骤同试验组。

（2）耐胆盐革兰阴性菌

试验组：取1：10的供试液 10 mL 置23 ℃培养2 h，取1 mL（相当于0.1 g供试品）的预培养物至2管 10 mL 的肠道菌增菌液体培养基中，分别接种0.1 mL不大于100 cfu大肠埃希菌和铜绿假单胞菌菌悬液，34 ℃培养 24 h后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，34 ℃培养18 h。菌液对照组：不含供试液，其余步骤同试验组。供试品对照组：不加试验菌，其余步骤同试验组。阴性对照：取稀释液10 mL转接至100 mL TSB中，不加试验菌，其余步骤同试验组。

（3）沙门菌

试验组：取供试品10 g接种至200 mL的TSB中，均质混匀，加入含菌量不大于100 cfu乙型副伤寒沙门菌菌悬液0.1 mL，34 ℃培养18 h。取上述培养物0.1 mL接种至10 mL的RV沙门菌增菌液中，34 ℃培养18 h后划线接种于XLD平板，34 ℃培养18 h。菌液对照组：不含供试品，其余步骤同试验组。供试品对照组：不加试验菌，其余步骤同试验组。阴性对照：不加供试品和试验菌，其余步骤同试验组。

（4）结果判断

控制菌检查方法适用性试验的试验组应检出相应的控制菌。

2 结果与分析

2.1需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验结果

（1）需氧菌总数计数方法适用性试验结果

中药制剂有可能存在一定的抑菌性，在进行痤疮消丸、补肾强身丸、丹曲降脂丸、妇炎丸、化痰散结丸、精道排毒丸、益气解毒丸、治胃丸的需氧菌总数计数方法适用性试验时，考察了上述8种供试品1：10和1：20两种不同浓度的供试液的需氧菌总数计数，结果显示，两种浓度的供试液的试验菌回收比值均在0.5～2.0范围内，且阴性对照组的培养结果为0 cfu，结果如表1所示，提示8种供试品制成1：10的供试液，其抑菌活性已完全消除，确认为供试品稀释成1：10的供试液，供试品中的微生物能被充分检出。因此上述8种供试品的需氧菌总数计数采用常规稀释法制成1：10的供试液，平皿法（倾注法）进行计数。

（2）霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验结果

痤疮消丸、补肾强身丸、丹曲降脂丸、妇炎丸、化痰散结丸、精道排毒丸、益气解毒丸、治胃丸的霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验结果显示，阴性对照组的菌落数为0 cfu，供试液稀释级为1：10，8个制剂的试验菌回收比值均在0.5～2.0之间，结果如表2所示，检查结果符合药典要求。因此，可采用供试品（1：10）常规平皿法进行上述8个制剂的霉菌和酵母菌总数计数实验。

（3）控制菌检验方法适用性试验

痤疮消丸、补肾强身丸、丹曲降脂丸、妇炎丸、化痰散结丸、精道排毒丸、益气解毒丸、治胃丸均含有药材原粉，控制菌检查除了大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌以外，还必须检查沙门菌，控制菌检查的结果如表3所示，试验组及菌液对照组均检出相应的试验菌株，供试品组和阴性对照组未检出。根据试验结果，确定了上述8个制剂的控制菌检查均可采用常规法进行。

3.小结与讨论

本次方法适用性研究，确定了医院中药制剂痤疮消丸、补肾强身丸、丹曲降脂丸、妇炎丸、化痰散结丸、精道排毒丸、益气解毒丸、治胃丸等8个品种的微生物限度检查法，即：采用常规法进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数（1：10供试液平皿倾注法）以及控制菌检查。本次研究的供试品是含药材原粉的丸剂，若采用薄膜过滤法去除抗菌活性，则容易导致滤膜堵塞，滤膜上的中药残渣会影响菌落计数，因此采用常规法平皿法进行适用性验证。制剂对微生物的抑制作用与其含有的抑菌成份成正比，本研究1：10的供试液均显示已无抑菌作用或抑菌作用可忽略不计，可能与制剂处方中具有抑菌作用的药材含量较少有关。建立适宜的检查方法，能够使药品中可能受到污染的微生物被充分地分离检查出来，保证微生物限度检查结果的可靠性。建立医疗机构中药制剂的检验方法，提高监管技术能力，是确保医院中药制剂的临床使用安全、有效的重要手段，是医院中药制剂持续健康发展的基础保障。

参考文献

[1] 丘振文，周本杰，唐洪梅，等.浅谈医院制剂的发展现状[J].中国医药导刊，2022，24（5）：446-449.

[2] 杨忠奇，汤慧敏，唐雅琴，等.试论真实世界研究与人用经验在中药新药研发中的应用[J].中国中药杂志2021，46（22）：5987-5991.

[3] 张 平，石春红，胡亚英，等.50种中药煎煮类饮片微生物检查方法研究及污染情况分析［J］.中国药业2021，30（3）：40 – 44.

[4] 李得堂，刘翠珍，宛鑫，等.医院中药制剂生产与质量控制要点浅析[J].中国医药导刊，2022，5（ 24） ： 454-459．

[5] Renhui YANG，Yongmin CHEN，Yufen XIA，et al.Establishment of Microbial Limit Test Methods for Two Hospital Preparations[J] Agricultural Biotechnology， 2023，12（3）：92-94.

[6] 杨 燕，李 芳，秦 峰，等.常用儿童药品的微生物限度检查方法的建立及评价[J].上海预防医学，2022，7（34）：693-697.

[7] 刘 钰，吴无畏，付书婕，等.加味消毒饮颗粒微生物限度检查方法学验证[J].中国医药导报，2021，18（36）：103-106.

[8] 国家药典委员会.中华人民共和国药典 （四部 ） [M].北京：中国医药科技出版社，2020：160-170.

作者简介：高土玲（1986年---），女，黎族，海南儋州，硕士研究生，海南省检验检测研究院三亚分所，制药工程师，研究方向为食品药品微生物检验检测，