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摘要：目的 基于过敏性鼻炎-哮喘综合征（CARAS）模型，探讨咽喉清（YHQ）对CARAS的调节作用。Balb/c小鼠随机分为正常对照组（Control）、过敏性鼻炎-哮喘综合征模型组（CARAS）、咽喉清（YHQ）治疗组、地塞米松（Dex）治疗组。YHQ和Dex组每天灌胃给药进行治疗。治疗结束后，观察小鼠行为学改变和鼻黏膜炎症浸润情况；检测血清白介素-4、白介素-5、白介素-13和OVA-sIgE的水平和脾脏中CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞比例。结果 YHQ组CARAS小鼠挠鼻（87.7112.62次/15 min）和打喷嚏次数（5.330.67次/15 min）分别显著降低至60.337.50次/15 min（p<0.01）和 2.670.67次/15 min（p<0.01）；HE结果显示小鼠鼻粘膜炎性细胞浸润降低；AR组血清中OVA-sIgE（0.960.07 ng/ml）、IL-4（105.304.74 pg/ml）、IL-5（55.992.97 pg/ml）和IL-13（156.404.21 pg/ml）水平分别降低至OVA-sIgE（0.560.0 ng/ml，p<0.01）、IL-4（62.726.16 pg/ml）、IL-5（37.552.45 pg/ml，p<0.01）和IL-13（121.206.74 pg/ml，p<0.01）水平；卵清蛋白诱导的CARAS模型组中CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞比例为3.350.26%，咽喉清治疗后显著上升至4.940.26%（p<0.05）。结论 咽喉清治疗可以上调卵清蛋白诱导的CARAS小鼠脾脏中Treg细胞比例，降低血清中2型免疫细胞因子水平，缓解小鼠鼻粘膜和肺组织炎性细胞浸润，缓解小鼠CARAS相关症状。

关键词：过敏性鼻炎-哮喘综合征；咽喉清；Treg细胞；2型免疫反应

Abstract：Aims This study is designed to investigate the curative effects and underlying immune mechanism of Yan-Hou-Qing（YHQ）on OVA induced combined allergic rhinitis and asthma syndrome（CARAS）in mouse model. Methods Four groups including Control group，CARAS group，Yan-Hou-Qing treatment group（YHQ）dexamethasone treatment group（Dex），were set for this study. After the treatment，the behaviors and inflammatory cell infiltration in nasal and lung were recorded. The sera cytokines and CD4+CD25+ Foxp3+ Treg in spleen were also determined. Results The up-regulated frequencies of sneezing and nasal rubbing and inflammatory cell infiltration in nasal tissues and lung tissues in CARAS model were reversed significantly by YHQ. The increased sera levels of IL-4，IL-13，OVA-sIgE and ratios of CD4+CD25+ Foxp3+ Treg in CARAS group were down-regulated by YHQ. Conclusions YHQ attenuates CARAS related symptoms associated with down-regulation of type 2 immunity and enhancement of CD4+CD25+ Foxp3+ Treg in CARAS mouse model.

Key words：CARAS；Yan-Hou-Qing；Regulatory T cell；Interleukin-4；Interleukin-13；Specific Immunoglobulin E

过敏性鼻炎-哮喘综合征（combined allergic rhinitis and asthma syndrome，CARAS）属于气道慢性炎症性疾病；其中过敏性鼻炎与哮喘属于同一气道，具有类似的发病机制，在治疗等方面也许多共通之处，两者之间彼此关联，相互影响[1] [2]。西医治疗CARAS多采用联合抗炎对症治疗，常用药物有吸入性糖皮质激素等治疗，然而这些药物表现出的激素依赖副作用及停药后易复发等问题一直困扰广大CARAS患者[1]。

中医药在呼吸系统疾病防治方面疗效确切，在调节呼吸系统炎症疾病的发生发展的进程中起到了重要作用[3]。咽喉清是由深圳市龙岗区耳鼻咽喉医院开发的中药制剂（医疗机构制剂注册批件粤药制字Z20090013），作为院内制剂广泛用于呼吸道炎症疾病的治疗。研究表明，咽喉清具有显著的抗炎作用，但是咽喉清对CARAS的治疗作用和机制仍有待进一步研究[4-6]。本研究中我们基于CARAS小鼠模型探讨了咽喉清对CARAS的治疗作用。

1材料与方法

1.1咽喉清制备

咽喉清口含片的生产委托给广州康缘药业有限公司（中国广州）按照标准操作程序进行。简而言之标准操作程序如下：金银花、玄参、胖大海、青果、诃子、罗汉果沸水回流提取2小时，提取两次，过滤合并提取液，然后在60℃下减压浓缩。金果榄、射干、桔梗、山豆根、锦灯笼是用60%的乙醇水溶液回流提取3次，60℃下减压浓缩。合并上述两种提取液，150 ℃下用热空气进一步喷雾干燥，药材提取率约为23.3%。喷雾干燥后的提取物与川贝母的粉末混合，添加粉状甜味剂后，将喷雾干燥，制备颗粒，压制成片，经过片剂包衣程序后，最终得到咽喉清口含片。

1.2动物、试剂和仪器

Balb/c小鼠（雌性，6-7周龄）购自广东医学实验动物中心；所有的小鼠都在无病原体的条件下，12小时光照/黑暗周期的空调环境中饲养。。

主要试剂和仪器：地塞米松（Sigma-Aldrich中国）；白介素-4、白介素-10、白介素-13、白介素-17、干扰素-γ和OVA-sIgE检测试剂盒（武汉华美）；APC anti-CD4抗体、PE anti-FOXP3抗体、FITC anti- CD25抗体（Biolegend），达优小鼠淋巴细胞分离液（深圳市达科为生物工程有限公司），细胞固定破膜剂（eBioscience），BD FACS Aria II流式细胞仪（BD Bioscience），酶标仪（Molecular Devices，USA），台式高速冷冻离心机（Thermo，USA），Nikon Eclipse Ci-L/S影像系统，Leica RM2245切片机（Leica，German）。

1.3小鼠CARAS模型造模及分组治疗

小鼠CARAS模型造模方法参考文献报道方法进行造模[7]。实验设置对照组（Control）、CARAS模型组、咽喉清组（200 mg/kg，YHQ）、地塞米松组（3 mg/kg，Dex）。YHQ组、Dex组式每天灌胃给药。

1.4咽喉清对小鼠CARAS调节作用评价

在末次给药2 h后，并卵清蛋白溶液滴鼻激发，记录小鼠挠鼻和打喷嚏的次数；苏木精&伊红（HE）染色分析鼻粘膜和肺组织炎症细胞浸润情况；按照酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒操作方法，检测血清白介素-4、白介素-10、白介素-13、和卵清蛋白特异性IgE水平；流式细胞术分析各组CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞比例。

1.5统计学分析

Graphpad Prism 5.0对实验数据进行统计和作图。实验数据以x ± s表示，单因素组间两两比较采用Dunnett's test检验，p<0.05视为差异有显著性。

2 结果

2.1 咽喉清对CARAS小鼠挠鼻和打喷嚏行为的影响

Control组小鼠15分钟内挠鼻和打喷嚏次数分别为6.17±1.42次和3.170.70次；CARAS组中小鼠挠鼻次数分别为26.83±2.09次（p<0.01）和9.000.57次（p<0.01），较对照组显著上升；经咽喉清治疗后，挠鼻次数和打喷嚏次数分别显著降低到17.67±2.03次（p<0.05）和6.170.60次（p<0.01）（图1）。

卵清蛋白（OVA）诱导的CARAS组挠鼻（87.7112.62次/15 min）和打喷嚏次数（5.330.67次/15 min）均较对照组（11.292.85次/15 min，0.330.33次/15 min，）显著升高；咽喉清（YHQ）治疗组挠鼻（A）次数（60.337.50次/15 min）均较小鼠CARAS组显著下降；咽喉清（YHQ）治疗组打喷嚏（B）次数（2.670.67次/15 min）均较小鼠CARAS组显著下降；##p < 0.01 vs. Control，*p < 0.05，**p < 0.01 vs. Allergic Rhinitis（AR）；x ± s，n = 6。

2.2 咽喉清对CARAS小鼠鼻黏膜和肺组织形态的影响

苏木精&伊红对鼻粘膜和肺组织染色，CARAS模型组小鼠鼻黏膜厚度增加，肺组织气管炎细胞浸润较对照组明显增加（见图2和图3）。YHQ及Dex组鼻黏膜增厚现象明显改善，肺组织炎性细胞浸润状况也相应减少（见图2和图3）。

AR小鼠经咽喉清（YHQ）和地塞米松（Dex）治疗后，小鼠过敏性鼻粘膜组织红肿状况减轻，炎细胞浸润显著改善。

CARAS小鼠经咽喉清（YHQ）和地塞米松（Dex）治疗后，小鼠过敏性肺粘膜组织气管周围炎细胞浸润减轻。

2.3 咽喉清对CARAS小鼠血清细胞因子的作用

CARAS模型组小鼠血清IL-4（38.70±9.89 pg/ml，p<0.0001）、IL-13（51.31±9.84 pg/ml，p<0.01）和OVA-sIgE（1.197±0.06 ng/ml，p<0.01）水平均显著高于Control组IL-4（6.35±1.73 pg/ml）、IL-13（6.83±2.64 pg/ml）、OVA-sIgE（0.04±0.01 ng/ml）（见图4）。与CARAS模型组比较，YHQ组小鼠血清IL-4（11.69±2.18 pg/ml，p<0.01）、IL-13（16.39±2.16 pg/ml，p<0.01）、OVA-sIgE（0.47±0.05 ng/ml，p<0.01）浓度下降成都较CARAS有显著性差异（见图4）。

CARAS模型组中，小鼠血清中OVA-sIgE（0.960.07 ng/ml，A）、IL-4（105.304.74 pg/ml，B）、IL-5（55.992.97 pg/ml，C）和IL-13（156.404.21 pg/ml，E）水平较对照组OVA-sIgE（0.230.01 ng/ml）、IL-4（46.014.87 pg/ml）、IL-5（33.271.97 pg/ml）和IL-13（115.504.80 pg/ml）显著上升（p < 0.01）。咽喉清治疗可以显著降低CARAS小鼠血清中OVA-sIgE（0.560.0 ng/ml）、IL-4（62.726.16 pg/ml）、IL-5（37.552.45 pg/ml）和IL-13（121.206.74 pg/ml）水平（p < 0.01）；##p < 0.01 vs. Control，*p < 0.05，**p < 0.01，vs. Allergic Rhinitis（AR）；x ± s，n = 6。

2.4 咽喉清对CARAS小鼠脾脏中CD4+CD25+ Foxp3+ Treg细胞比例的影响

卵清蛋白诱导的CARAS模型组中CD4+CD25+ Foxp3+ Treg细胞比例为8.531.70%（p<0.01，见图5），显著低于Control组小鼠脾脏中的CD4+CD25+ Foxp3+ T水平14.262.00%。经咽喉清治疗后，同CARAS模型组比较，咽喉清治疗组（12.562.31%，p<0.01）中CD4+CD25+ Foxp3+ T细胞比例显著上升。

卵清蛋白诱导的CARAS模型组中CD4+CD25+ Foxp3+ Treg细胞（3.350.26%，AR组）较对照组（5.800.34%，Control组）显著增加；咽喉清治疗后，CARAS小鼠脾脏中CD4+CD25+ Foxp3+ Treg细胞较AR组（4.940.26%，YHQ组）显著上升；##p < 0.01 vs. Control，*p < 0.05，**p < 0.01，vs. Allergic Rhinitis（AR）；x ± s，n = 6。

3 讨论

CARAS是特异性个体暴露与过敏原后，机体启动2型免疫反应，导致肥大细胞等效应细胞释放生物活性介质，刺激平滑肌收缩、血管通透性和腺体分泌增加，引发喷嚏、鼻痒、喘鸣等CARAS症状[1]。我们研究发现，咽喉清治疗后明显降低机体2型免疫反应，减轻鼻粘膜和肺组织嗜酸性粒细胞等炎性细胞的浸润，减少CARAS小鼠挠鼻和打喷嚏的次数。

该研究中，咽喉清治疗后，可以逆转卵清蛋白诱导高表达的Th2型细胞因子白介素-4、白介素-10、白介素-13、和卵清蛋白特异性IgE。调节性T细胞（Regulatory T cell，Treg）对维持机体免疫平衡，调节过敏反应具起到重要作用[8-9]。流式细胞术结果表明，CARAS组小鼠脾脏中CD4+CD25+ Foxp3+ T淋巴细胞较Control组显著下降，而咽喉清治疗可以恢复CD4+CD25+ Foxp3+ T淋巴细胞至正常组水平。综上所述，咽喉清可通过诱导Treg分化，抑制机体2型免疫反应，改善小鼠CARAS症状。

利益相关声明：文章所有作者共同认可文章无利益冲突。

作者贡献说明：程保辉负责实验设计、论文撰写；曾浩涛负责实验；张华负责数据分析；曾宪海进行了论文的修改与指导。

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基金项目：国家自然基金（81973915、81773978），深圳市医学重点学科建设经费资助（NO.SZXK039）、龙岗区医疗卫生科技计划项目（LGKCYLWS2020098、LGWJ2022-110）。

作者简介：第一作者：曾浩涛、1980年3月、男、汉族、广东揭阳、硕士，副主任药师，研究方向：药品管理与新药开发研究